植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的組成、儀器設(shè)備及基本操作(精要)課件

植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的組成、儀器設(shè)備及基本操作一、植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)構(gòu)及設(shè)計(jì)要求：

完整的植物組織培養(yǎng)室通常包括洗滌室、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、接種室、培養(yǎng)室、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室等部分。可以根據(jù)實(shí)際需要和條件進(jìn)行設(shè)計(jì)。但從功能上至少包括準(zhǔn)備室（化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）、接種室以及培養(yǎng)室三部分，并且按順序排列。在化學(xué)實(shí)驗(yàn)室與接種室之間應(yīng)留有緩沖空間。第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)、儀器設(shè)備及操作技術(shù)（一）準(zhǔn)備室（化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）：

1.主要功能：

用于培養(yǎng)器皿的清洗、干燥、培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌、試管苗的出瓶及整理等工作。

（二）接種室（無菌操作室）：

1、功能：

接種材料的滅菌、接種以及培養(yǎng)物的繼代轉(zhuǎn)接等。接種室要求保持潔凈，與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室之間應(yīng)設(shè)置緩沖室。2、儀器設(shè)備及用品：

超凈工作臺(tái)、紫外燈、小推車、擱架、磁盤、接種工具（各種鑷子、解剖刀、手術(shù)剪、普通剪刀接種針、酒精燈、手持噴霧器、細(xì)菌過濾器等）等。（三）培養(yǎng)室：

1、功能：主要用于植物材料的培養(yǎng)。要求室內(nèi)潔凈并能保持一定的溫度、光照以及濕度，以促進(jìn)植物材料的生長和分化。2、儀器設(shè)備及用品：

培養(yǎng)架及燈管、搖床（振蕩器）、空調(diào)、自動(dòng)定時(shí)器、加濕及除濕器、光照培養(yǎng)箱等。2、儀式設(shè)備及用品：

體視顯微鏡、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、配套顯微照相裝置、普通相機(jī)或數(shù)碼相機(jī)、切片機(jī)及配套制片及染色用品等。普通光學(xué)顯微鏡用途：用于植物切片觀察，確定植物的發(fā)育進(jìn)程，如：不定芽、不定胚的分化過程以及其它器官組織的分化等。（一）洗滌：

1.普通器皿：采用洗衣粉、洗潔精等中性洗滌劑洗滌。

2.難清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重鉻酸鉀洗液浸泡，最后清水沖洗，或用超聲波儀清洗。

重鉻酸鉀洗液的配制方法：43g重鉻酸鉀溶于1000ml蒸餾水中，將濃硫酸緩慢倒入重鉻酸鉀溶液中，濃度比例為1：1。二、實(shí)驗(yàn)室基本操作：1、器具滅菌：培養(yǎng)皿、解剖刀、鑷子等用品。

（1）干熱滅菌：鋁箔包好后，放于恒溫干燥箱內(nèi)，150℃保溫2小時(shí)，成本較高。

（2）高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)120℃15－20分鐘。

（3）灼燒滅菌：接種時(shí)，解剖刀及鑷子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精燈火焰上灼燒殺菌。（二）滅菌：

滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物（包括芽胞），使之呈無菌狀態(tài)。經(jīng)過滅菌的物品稱“無菌物品”。2、培養(yǎng)基滅菌：

采用高壓蒸汽滅菌。120℃15－20分鐘。培養(yǎng)基體積越大，滅菌時(shí)間越長。高溫高壓滅菌對培養(yǎng)基成分的影響：

a.pH值普遍下降。

b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會(huì)產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。

c.不少培養(yǎng)基顏色加深。

d.體積和濃度有所變化。

e.營養(yǎng)成分有時(shí)受到破壞。3、不耐高溫材料的滅菌：

采用過濾滅菌，如IAA、ZT、天然有機(jī)添加物等。（三）無菌操作：

1、保持接種室的無污染環(huán)境，定期熏蒸或噴霧處理。接種前打開超凈工作臺(tái)及紫外燈照射20-30分鐘，關(guān)閉紫外等燈后使氣體散出后開始操作。

2、保持超凈工作臺(tái)的潔凈：接種前用70％乙醇擦拭臺(tái)面或用噴壺噴霧，操作前，將手和手臂用70％乙醇消毒，所需試驗(yàn)用品用乙醇擦拭后放入超凈工作臺(tái)。3、點(diǎn)燃酒精燈，進(jìn)行操作，接種材料前后，灼燒瓶口，工具要灼燒徹底，防止交叉污染。4、保持培養(yǎng)室的潔凈，發(fā)現(xiàn)污染及時(shí)挑出，以減少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接種室換拖鞋以保持接種室的潔凈。第二章植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的組成、儀器設(shè)備及基本操作第二節(jié)培養(yǎng)基的組成、配制與滅菌一、培養(yǎng)基（medium）的組成和作用

通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以下六大類成分，即礦質(zhì)營養(yǎng)、有機(jī)成分、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。培養(yǎng)基的主要指標(biāo)是:

營養(yǎng)成分的濃度植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度礦質(zhì)元素的生理作用：（1）組成各種化合物，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；（2）許多酶和附酶的組成部分，參與代謝；（3）維持離子平衡、膠體穩(wěn)定及電荷平衡等電化學(xué)作用；（4）影響形態(tài)發(fā)生和組織、器官的建成等。

根據(jù)植物對元素的吸收量，可以把植物必需元素分為大量元素和微量元素。

國際植物生理學(xué)會(huì)規(guī)定植物所需濃度大于0.5mmol/l的的元素稱為大量元素。低于0.5mmol/l的元素稱為微量元素。

大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S分別占植物干重的百分?jǐn)?shù)為18％、10％、70％、0.3%、0.07％、0.3%、0.3％、0.07%、0.05％。

微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。1、大量元素：

N、P、K、Ca、Mg、S等6種大量元素依靠各種無機(jī)鹽提供。不同植物種類和不同試驗(yàn)?zāi)康膶υ氐氖褂昧恳蟛煌?，需?jīng)試驗(yàn)確定。目前已選擇出多種培養(yǎng)基配方用于植物組織培養(yǎng)。其中以MS應(yīng)用最廣泛。以MS為例6中礦質(zhì)元素分別由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO47H2O、CaCl24H2O提供。

大量元素中的氮通常采用硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但銨態(tài)氮濃度過高會(huì)對有些植物的培養(yǎng)物造成傷害，不適宜使用過高的濃度，可以用谷氨酸、絲氨酸等來代替。2、微量元素：植物組織的對其需要量極少，過多會(huì)產(chǎn)生毒害，如造成蛋白質(zhì)變性、酶失活,代謝障礙等。各種微量元素均具有特定的生理功能，如硼與蛋白質(zhì)的合成及糖類的運(yùn)輸有關(guān)；銅能促進(jìn)離體根的形成；錳參與植物的光合作用和呼吸作用；鉬為氮素代謝的重要元素。

微量元素中，鐵的用量較大，它對葉綠素的合成起重要作用，由于在較高pH下，F(xiàn)eCl3極易形成Fe（OH）3沉淀，難以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二鈉鹽與硫酸亞鐵形成的螯合物，并且單獨(dú)配制。（二）有機(jī)成分：

主要包括各種維生素和氨基酸常用的維生素：硫胺素（VB1）、吡哆醇（VB6）、煙酸（VB3）、泛酸鈣（VB5）、生物素、鈷胺素（VB12）、葉酸等。常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有時(shí)添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，為牛乳經(jīng)酶法加工的水解產(chǎn)物，含有20種氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L,通常用于原生質(zhì)體等培養(yǎng)。此外肌醇是另外一種重要的有機(jī)成分，在維持離子平衡，糖類的轉(zhuǎn)化中起重要作用，此外還參與磷脂代謝及等生理作用。它可以促進(jìn)愈傷組織的形成，不定芽、不定胚的分化。（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：植物激素是植物代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能直接影響植物細(xì)胞的分化、分裂以及影響植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動(dòng)。在植物組織培養(yǎng)中，主要通過植物激素及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對離體的組織、器官的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。包括誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、愈傷組織的生長、根芽的分化以及體細(xì)胞胚胎發(fā)生等。

常用的植物激素及生長調(diào)節(jié)物涉及五大類植物激素：1、生長素類：2、細(xì)胞分裂類：3、赤霉素類：4、脫落酸：5、多胺6、乙烯：1、生長素類：

組織培養(yǎng)中的功能是：促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)形成愈傷組織，促進(jìn)生根。常用的有NAA、IAA、IBA、2,4－D等。2、細(xì)胞分裂素類：功能：誘導(dǎo)芽的分化、促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)；促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，促進(jìn)莖增粗，抑制莖伸長；延緩衰老。常用細(xì)胞分裂素有BA、KT、ZT、2ip等。

此外近年來發(fā)現(xiàn)苯基脲衍生物具有非常高的細(xì)胞分裂素活性，在多種植物上應(yīng)用。如TDZ，CPPU，4－PU等。3、赤霉素類：主要具有誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長，對根無效；對形成層細(xì)胞分化有影響，與生長素協(xié)同作用；可以誘導(dǎo)離體成花；打破休眠等功能。常用GA3、GA4等。4、脫落酸（ABA）：促進(jìn)休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng)中較少使用，主要用于種質(zhì)資源的離體保存。5、乙烯：主要促進(jìn)衰老和脫落，高濃度易形態(tài)變化。（四）碳源：碳源主要為細(xì)胞提供合成新化合物的骨架，為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持一定的滲透壓。常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在10－50g/L，此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物組織培養(yǎng)。（五）瓊脂：瓊脂作為固化劑用于組織培養(yǎng)中，起支持植物的作用，不提供營養(yǎng)，為海藻中提取的一種高分子化合物，僅溶于熱水（90oC以上），成為凝膠，冷卻后（40oC以下）即凝固為凝膠。瓊脂的用量通常在4～10g/L。（六）有機(jī)附加物：

1、椰子汁：用量為100～200g/L。

2、香蕉泥：使用量為150～200g/L。

3、蘋果汁、番茄汁等。（七）其他成分：

1、活性炭：使用量為0.2-1%。

2、抗生素：常用青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5～20mg/L。

3、抑制酚類物質(zhì)：抗壞血酸.

4、生長抑制劑：常用矮壯素、比久（B9）、多效唑（pp333）、三碘苯甲酸、根皮酚等.二、培養(yǎng)基的類型：1、高鹽濃度培養(yǎng)基：MS、B5、SH等。適用于多數(shù)營養(yǎng)需求量較大的植物。2、低鹽培養(yǎng)基：WPM、White、Nitsh等。適用于木本植物的培養(yǎng)。表1

MS培養(yǎng)基的組成配方組成成分?jǐn)?shù)量(mg/l)組成成分?jǐn)?shù)量(mg/l)NH4NO31650Na2-EDTA37.3KNO31900FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O440CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O370蔗糖30KH2PO4170pH5.8KI0.83肌醇100.0H3BO36.2煙酸0.5MnSO4·4H2O22.3鹽酸吡哆醇0.5ZnSO4·7H2O8.6甘氨酸2.0Na2MoO4·2H2O0.25鹽酸硫銨等0.4CoCl2·6H2O0.025表2

B5培養(yǎng)基的組成和配方組成成分?jǐn)?shù)量(mg/l）組成成分?jǐn)?shù)量(mg/l)KNO32500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4

134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO4

3.0煙酸1.0MnSO4·4H2O10鹽酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激動(dòng)素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025鹽酸硫銨10Na2-EDTA37.3

表3N6培養(yǎng)基的組成和配方組成成分?jǐn)?shù)量(mg/l)組成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463煙酸0.5KI0.8鹽酸吡哆醇0.5H3BO3

1.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4鹽酸硫銨1.0ZnSO4·7H2O1.5三、培養(yǎng)基母液及激素母液的配制：

由于培養(yǎng)基中元素用量少，種類多，因此每次稱量繁瑣，因此通常將各種營養(yǎng)成分配制成母液保存。大量元素微量元素有機(jī)營養(yǎng)激素1、器皿和用具的準(zhǔn)備

儀器包括萬分之一天平，百分之一天平，pH計(jì)用品包括不同型號的燒杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、試劑瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）、滴管、玻璃棒、試管、各種規(guī)格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、培養(yǎng)基分裝器，漏斗、稱量紙、標(biāo)簽紙、不同范圍pH試紙、鉛筆等。玻璃器皿用前清洗干凈。2、藥品及蒸餾水準(zhǔn)備：

藥品采用分析純或化學(xué)純試劑。水利用蒸餾水或去離子水。3、母液配制：

（1）配制母液原則：

相同類型的試劑混合；易形成沉淀的藥品分開；母液濃度要適宜；用量要認(rèn)真計(jì)算和核對；藥品要準(zhǔn)確稱量。

（2）MS培養(yǎng)基母液的配制：

MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成四種母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe鹽（100倍）、有機(jī)物（100倍）。配置前先進(jìn)行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配制體積計(jì)算母液試劑用量，然后稱取藥品，大量元素可以用百分之一或千分之一