DB22T3353-2022豬δ冠狀病毒檢測 重組酶聚合酶擴增(RPA)法

ICS11.220CCSB41

DB22吉 林 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB22/T3353—2022豬δ冠狀病毒檢測重組酶聚合酶擴增（RPA）法RecombinasepolymeraseamplificationmethodforthedetectionofRecombinasepolymeraseamplificationmethodforthedetectionofporcinedeltacoronavirus2022012820220228吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3353DB22/T3353—2022前 言GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本文件起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件主要起草人：王開、裴志花、胡桂學(xué)、孟凡茹、郭衍冰、邵洪澤、王海軍、張德文、趙玉龍。IIDB22/T3353DB22/T3353—2022DB22/T3353—DB22/T3353—2022合物中重組酶解離引物后暴露的3′端，進行片段擴增，形成兩條新的雙鏈DNA，如此循環(huán)，從而完成對目的片段的擴增。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果判定。豬δ冠狀病毒檢測重組酶聚合酶擴增(RPA)法范圍本文件規(guī)定了豬δ樣品、試驗步驟和結(jié)果判定。本文件適用于豬δ冠狀病毒的實驗室檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 動物檢疫3術(shù)語和定義3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增reversetranscription-recombinasepolymeraseamplification一種由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換Bsu聚合酶參與的恒溫擴增技術(shù)。4縮略語下列縮略語適用于本文件。cDNA 互補脫氧核糖核酸（ComplementaryDeoxyribonucleicAcid）DEPC焦碳酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate）DNA脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）MgAc醋酸鎂（MagnesiumAcetate）PBS磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSolution）RT-RPA 反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增（ReverseTranscription-recombinasePolymeraseAmplification）5原理RPADNA進行定位，完成定位后發(fā)生鏈交換反應(yīng)，形成D-DNA結(jié)合蛋白與單鏈DNA鏈綁定。隨后DNA聚合酶識別復(fù)1試劑和材料試劑除另有說明，本方法僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。RPA1。表1引物序列引物序列（5′→3′）片段大小PDCoV-RPA-FATGTGCCTGGTGTTCAGGAGATGCTTTTCGCTGGC185bpPDCoV-RPA-RAGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCATAGGTCTGGTTA磷酸鹽緩沖液（PBS）（0.01mol/L，pH7.4）。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒。TwistAmpBasicRTKit。DEPC瓊脂糖。MarkerDL瓊脂糖。MarkerDL2000bp。A。陰性對照，DEPC材料無菌棉簽。鋼絲網(wǎng)（300目）。7儀器設(shè)備8生物安全27.1電子天平，感量0.01g。7.2臺式低溫高速離心機（4℃，12000r/min）。7.3移液器（0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μL～200μL、200μL～1000μL）。7.4恒溫水浴鍋。7.5高壓蒸汽滅菌器。7.6冰箱，-20℃。7.7電泳儀。7.8垂直板電泳槽。7.9凝膠成像儀NY/T541的規(guī)定執(zhí)行。GB19489的規(guī)定執(zhí)行。樣品腸組織5g（7.1）4運輸。9.1.210%PBS（6.1.2）300（6.2.2），收集濾液，12000r/min離心10min（7.2），取上清液待檢。9.1.3如不能立即檢測，應(yīng)保存于-20（7.6）。糞便使用無菌棉簽（6.2.1,7.5），5g，410%PBS300000r/min10min，取上清液待檢。如不能立即檢測，應(yīng)保存于-20RNA按照商品化試劑盒（6.1.3）說明書要求提取相應(yīng)樣品的RNA。或采用等效方法提取RNA。RNA按照商品化試劑盒（6.1.3）說明書要求提取相應(yīng)樣品的RNA?；虿捎玫刃Х椒ㄌ崛NA。cDNA按照商品化試劑盒（6.1.4）說明書將10.1提取的樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為檢測模板。擴增反應(yīng)體系豬δ冠狀病毒RPA擴增反應(yīng)（6.1.5）體系見表2。同時設(shè)定陰性、陽性樣品對照。表2豬δ冠狀病毒RPA擴增反應(yīng)體系10.4 反應(yīng)程序3試劑劑量Rehydrationbuffer29.5μLcDNA模板2.0μLPDCoV-RPA-F2.4μLPDCoV-RPA-R2.4μLDEPC水（6.1.6）11.2μLMgAc2.5μL總體積50.0μLDB22/T3353DB22/T3353—2022DB22/T3353DB22/T3353—2022反應(yīng)溫度反應(yīng)體系置于42℃水浴鍋中（7.4）。反應(yīng)時間反應(yīng)時間為25min。電泳觀察（6.1.11）和檢測樣品Marker（6.1.9）分別加入凝膠孔（7.3），5V/min30min（7.7,7.8），再取出凝膠通過凝膠成像儀觀察結(jié)果（7.9）。結(jié)果判定試驗成立條件185bp擴增條帶參見附錄照、陰性對照任意一項不滿足以上條件，此次試驗視為無效。試驗結(jié)果判定陽性結(jié)果被檢樣品出現(xiàn)185bp條帶，判為核酸陽性。被檢樣品出現(xiàn)185bp條帶，判為核酸陽性。11.2.2 陰性結(jié)果185bp條帶時，判為核酸陰A。4附錄A（規(guī)范性）豬δ冠狀病毒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒根據(jù)PDCoVNH株（GenBank：KU981062）的N基因序列，獲得陽性克隆的基因序列。PDCoV陽性質(zhì)粒的基因序列Atggctgcaccagtagtccctactactgacgcgtcttggtttcaggtgctcaaagctcaaaataaaaaggctactcatcctcagtttcgtggcaatggagttccgcttaactccgccatcaaacccgttgaaaaccatggctactggctgcgttacaccagacaaaagccaggtggtactccgattcctccatcctatgccttttattatactggcacaggtcccagaggaaatcttaagtatggtgaactccctcctaatgacaccccagcaaccactcgtgttacttgggttaagggttcgggagctgacacttctattaagcctcatgttgccaaacgcaaccccaacaatcctaaacatcagctgctacctctccgattcccaaccggagatggcccagctcaaggtttcagagttgaccccttcaacgctagaggaagacctcaggagcgtggaagtggcccaagatctcaatctgttaactccagaggcacaggcaatcagcccaggaaacgcgaccaatctgcacccgctgcggtacgtcgtaagacccaacatcaagctcccaagcggactttacccaagggtaaaaccatttctcaggtatttggcaaccggtctcgcactggtgccaatgtcggctctgcagacactgagaagacgggtatggctgatcctcgcatcatggctctagccagacatgtgcctggtgttcaggagatgcttttcgctggccaccttgagagcaactttcaggcgggggcaattacccttaccttctcttactcaatcacagtcaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcgctcaatacggtcgttaaccagacctatgagccacccaccaaaccaactaaggacaagaagcctgacaaacaagaccagtctgctaaacccaaacagcagaagaaacctaaaaaggtaactctgccagcagacaaacaggattgggagtgggatgatgcttttgagataaagcaggaatcagcagcgtag連接PDCoVN基因與pET-28a連接（生工合成）。轉(zhuǎn)化將感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α1μL?3μL加入100μL30min；421min?2min1min?2min900μLLB180rpm，371h；200μL，LB12h?16h。菌落PCR鑒定PCR反應(yīng)體系：上/下游引物各1μL、ddH2O8μL、預(yù)混Taq酶10μL。PCR反應(yīng)程序：95℃，5min；9530s；58，30s，721min，7210min，35PCR103712h?16hPCR質(zhì)粒提取5用10μL槍頭挑取PCR檢測有目的條帶菌落，打入5mL含抗生素液體LB培養(yǎng)基的試管中