臨床免疫定性檢測的性能驗(yàn)證

臨床免疫定性檢測

的性能驗(yàn)證高速列車性能驗(yàn)證空氣動力學(xué)速度車體轉(zhuǎn)向架運(yùn)行固定、懸掛的零部件強(qiáng)度穩(wěn)定性舒適感故障率……第3頁測定系統(tǒng)方法學(xué)操作程序校準(zhǔn)品儀器試劑測定系統(tǒng)的關(guān)鍵要素醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)為什么需要“性能驗(yàn)證”？評價檢測系統(tǒng)是否滿足臨床檢測和認(rèn)可組織的要求（ISO15189）；驗(yàn)證廠家提供的試劑參數(shù)能否在本實(shí)驗(yàn)室得到重現(xiàn)。什么時候進(jìn)行性能驗(yàn)證使用新的檢測試劑或系統(tǒng)時；更換檢測試劑或系統(tǒng)時。更換新的試劑或系統(tǒng)意義：更易于操作更高的檢測性能更經(jīng)濟(jì)更能滿足實(shí)驗(yàn)室測定要求

一.

定性臨床應(yīng)用與分類1、定性測定的臨床應(yīng)用免疫學(xué)測定：感染性疾病、腫瘤標(biāo)志物核酸和基因檢測微生物檢驗(yàn)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)寄生蟲檢驗(yàn)2、定性實(shí)驗(yàn)的臨床分類篩查實(shí)驗(yàn)：如便潛血、TP診斷實(shí)驗(yàn)：如微生物學(xué)培養(yǎng)與細(xì)菌鑒定確認(rèn)實(shí)驗(yàn)：對以上已做出的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和確認(rèn)3.幾個重要概念

篩查試驗(yàn)：臨床上篩查方法通常用于檢測整個人群（或者人群中的特定部分）中特定指標(biāo)的情況。例如對需輸血患者樣本做HIV血清學(xué)試驗(yàn)。

一般來說，這些用于篩查的定性試驗(yàn)必須具有高敏感性以確保真陽性結(jié)果的檢出。如果篩查試驗(yàn)的假陽性結(jié)果所造成的社會及經(jīng)濟(jì)后果不是非常嚴(yán)重，這種低特異性可通過特異性較好的確認(rèn)試驗(yàn)加以彌補(bǔ)。CLSI

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Guideline3.幾個重要概念診斷試驗(yàn)：通常用于臨床懷疑某種特定疾病或狀況是否存在的診斷性定性試驗(yàn)。例如各種微生物培養(yǎng)就是用于檢查感染情況的診斷試驗(yàn)。

臨床上對治療的要求，診斷試驗(yàn)應(yīng)具有很好的敏感性和特異性。如果診斷試驗(yàn)后還進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，那么診斷試驗(yàn)的特異性要求可以稍微降低。CLSI

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Guideline3.幾個重要概念確認(rèn)試驗(yàn)：確認(rèn)試驗(yàn)用于驗(yàn)證篩查試驗(yàn)或者診斷試驗(yàn)結(jié)果。如果確診試驗(yàn)證實(shí)了之前的檢測結(jié)果，臨床醫(yī)生即可作出診斷。確認(rèn)試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)使其具有較高的特異性（有時甚至以犧牲敏感性為代價）以及高陽性預(yù)測值。免疫印跡試驗(yàn)就是一種用于HIV血清學(xué)試驗(yàn)等篩查試驗(yàn)之后的確認(rèn)試驗(yàn)。3.幾個重要要概念敏感性或陽性測測定能力力指數(shù)（（DI（＋）））：可定義為為一實(shí)驗(yàn)驗(yàn)對陽性性標(biāo)本測測定后給給出陽性性結(jié)果的的能力。。DI（＋）=[真陽性/（真陽性性+假陰性））]×100%特異性或陰性測測定能力力指數(shù)（（DI（－）））：則為對陰陰性樣本本測定給給出陰性性結(jié)果的的能力DI（－）=[真陰性/（真陰性性+假陽性））]×100%3.幾個重要要概念陽性預(yù)示示值：即測定為為陽性的的標(biāo)本實(shí)實(shí)際上為為陽性的的可能性性。=[真陽性/（真陽性性+假陽性））]×100%陰性預(yù)示示值:則為一份份給出陰陰性結(jié)果果的樣本本實(shí)際上上為陰性性的可靠靠性。=[真陰性/（真陰性性+假陰性））]×100%臨床診斷（金標(biāo)準(zhǔn)）總計(jì)陽性陰性驗(yàn)證方法陽性ABA+B陰性CDC+D總計(jì)A+CB+DN敏感度=100%×[A/（A+C）]特異性=100%×[D/（B+D）]相關(guān)樣本本的患病病率=100%××[（A+C））/N]陽性預(yù)測測值（PVP））=100%×[A/（A+B）]陰性預(yù)測測值（（PVN）=100%×[D/（C+D）]方法效率率（正確確率）=100%×[（（A+D）/N]“預(yù)示值””對臨床床檢驗(yàn)結(jié)結(jié)果影響響預(yù)示值對對一個有有95%敏感性和和95%特異性的的試劑檢檢測結(jié)果果的影響響（100,000人）

結(jié)果10%感染率1%感染率

檢出(+)未檢出(－)

檢出(+)未檢出(－)+9,50050095050

－4,50085,5004,95094,050敏感性(TP/[TP+FN])95%95%特異性(TN/[TN+FP])95%95%陽性預(yù)示值TP/[TP+FP]9500/[9500+4500]=67.9%950/[950+4950]=16%陰性預(yù)示值TN/[TN+FN]85500/[85500+500]=99.4%94050/[94050+50]=99.9%二.定性檢測系統(tǒng)統(tǒng)的性能能驗(yàn)證驗(yàn)證的內(nèi)內(nèi)容:1.正確度（（準(zhǔn)確度度）2.精密度3.敏感性4.特異性5.CUTOFF值值驗(yàn)證6.其他（需需要時））EP15A2EP17AEP12ClinicalLaboratoryandStandardsInstitute(CLSI)涉及免疫疫定性檢檢測評價價方法標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室精密度和準(zhǔn)確度的確認(rèn)檢出限與定量限的評價定性檢測評價臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)化協(xié)會會性能驗(yàn)證證前的準(zhǔn)準(zhǔn)備應(yīng)熟悉待待驗(yàn)證的的試劑或或系統(tǒng)進(jìn)行必要要的培訓(xùn)訓(xùn)，包括括樣本的處處理和儲儲存、試試劑的處處理和儲儲存、合合理的檢檢測方案案、對結(jié)結(jié)果合理理的解釋釋以及系系統(tǒng)的質(zhì)質(zhì)量控制制等。制定質(zhì)質(zhì)量保保證計(jì)計(jì)劃確定患患者樣樣本的的數(shù)量量及強(qiáng)強(qiáng)弱（（評價價重復(fù)復(fù)性））確定比比較的的方法法CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline性能驗(yàn)驗(yàn)證的的合格格標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)從何何而來來？試劑盒盒說明明書國際和和／或或國際際標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)性能驗(yàn)驗(yàn)證前前樣本本的準(zhǔn)準(zhǔn)備質(zhì)控品品：使使用商商品化化質(zhì)控控物進(jìn)進(jìn)行，，包括括陰性性和陽陽性。。樣本的的采集集和保保存：：采集集時間間、保保存方方式等等必須須保證證一致致性。。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline方法比比較用樣本本數(shù)量量取決于于評價價者的的目的的。作為最最低要要求，，檢測測要持持續(xù)到到至少少用比比較方方法獲獲得50個陽性性樣本。并且至至少用用比較較方法法獲得得50例陰性性樣本以確定定此種種檢測測方法法的特特異性性。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline1.準(zhǔn)確度度驗(yàn)證證1）檢測已已知值值的參考物物質(zhì)室間質(zhì)質(zhì)評材材料(衛(wèi)生部部或者者CAP)廠商提供的的已賦值的的參考材料料分析用參考考方法或決決定方法定定值的材料料。2）方法比比較試驗(yàn)：：樣本數(shù)為為10-20個，兩種方方法同時測測定同樣的的樣品，用用KAPPA檢驗(yàn)方法分分析兩種方方法檢測結(jié)結(jié)果一致性性.(比如HBV酶免法和發(fā)發(fā)光法比對對)選取40份份（20份份）樣本,最好陰陽陽性各半↓隨機(jī)盲法重重新分號↓檢測樣本↓將所有檢測測結(jié)果匯總總填表↓計(jì)算評價性性能指標(biāo)2.精密度驗(yàn)證證1）批內(nèi)精密度度:同一份樣本本在同一批批次內(nèi)平行行重復(fù)檢測測10次.然后計(jì)算均均值,SD和CV.2）批間精密度度:同一份樣本本連續(xù)檢測測10天,每天平行檢檢測雙孔.然后計(jì)算均均值,SD和CV.Note:用S/CO比值進(jìn)行統(tǒng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算.最好選擇臨臨界值,或弱陽性樣樣本.判斷標(biāo)準(zhǔn):批內(nèi)CV小于15%,批間CV小于25%.批內(nèi)重復(fù)性性的驗(yàn)證高、中、低低三個濃度度的樣本，，在一批檢檢測內(nèi)，重重復(fù)檢測20次（孔），，計(jì)算所得得S/CO值的均值和和SD，計(jì)算批內(nèi)內(nèi)CV%。判斷結(jié)論：：應(yīng)≤試劑劑說明書所所標(biāo)明的批批內(nèi)變異。。ELISA的批內(nèi)變異異CV%應(yīng)≤10%。批間重復(fù)性性的驗(yàn)證高、中、低低三個濃度度的樣本，，在10天以上時間間內(nèi)單次（（孔或管））重復(fù)進(jìn)行行20批檢測，計(jì)計(jì)算所得S/CO值的均值和和SD，計(jì)算批間間CV%。判斷結(jié)論：：應(yīng)≤試劑劑說明書所所標(biāo)明的批批間變異。。ELISA的批間變異異CV%應(yīng)≤15%。3.敏感性1）驗(yàn)證方法法:取10-20份已知真陽陽性的樣本本，用常規(guī)規(guī)檢測方法法檢測，計(jì)計(jì)算檢測陽陽性的樣本本占樣本總總數(shù)的比例例。2）樣本來源源:臨床診斷的的陽性病人人血清；廠家提供的的陽性對照照；決定性參考考方法檢測測陽性的樣樣本；以上陽性樣樣本來源緊緊張時，可可以進(jìn)行稀稀釋（如2：3，3：4這樣稀釋））4.特異性1）驗(yàn)證方法：選取20份正常健康康人血清（（一般取自自健康體檢檢者），計(jì)計(jì)算其檢測測陰性結(jié)果果所占百分分率。2）樣本來源:體檢樣本,體檢者確認(rèn)認(rèn)符合要求求后即可.NOTE:部分項(xiàng)目在在健康體檢檢人群中陽陽性率也很很高,此類項(xiàng)目特特異性驗(yàn)證證很難執(zhí)行行,建議引用廠廠家說明書書.比如麻疹病病毒IgG,CP-IgG,MP-IgG等一系列病病毒抗體IgG.因?yàn)楹茈y確確認(rèn)體檢者者既往是否否有過感染染史,而IgG抗體在體內(nèi)內(nèi)存留時間間長.因此很難收收集到真正正意義上的的陰性樣本本.特異性驗(yàn)證證（干擾））特定病原體體以外感染染性疾病患患者的樣本本。含有干擾性性物質(zhì)的樣樣本：類風(fēng)風(fēng)濕因子（（RF）陽性、含含異嗜性抗抗體、溶血血、脂血、、高膽紅素素樣本。結(jié)果判斷：：非特定病病原體感染染患者樣本本均應(yīng)為陰陰性。含一一定濃度干干擾物質(zhì)的的樣本檢測測應(yīng)為陰性性。5.CUT-OFF重復(fù)性和測定下限限驗(yàn)證CUT-OFF重復(fù)性驗(yàn)證證：樣本濃濃度應(yīng)接近臨界值。不宜用陰性性或強(qiáng)陽性性樣本。批內(nèi)和批間間變異驗(yàn)證證：高、中中和低三個個濃度（與與試劑盒說說明書中所所述相適應(yīng)應(yīng)）臨界點(diǎn)的定義同樣一份樣樣本，在多多次重復(fù)實(shí)實(shí)驗(yàn)中各有有50%的幾率獲得得陽性或陰陰性的結(jié)果果時該分析析物的濃度度。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline臨界點(diǎn)（CUT-OFF)與試劑盒判判斷值（CUT-OFF值）的區(qū)別別這里的臨界點(diǎn)指的是一個個處于試劑劑檢測臨界界點(diǎn)的樣本濃度，其一旦確確定，是不不變的。試劑盒CUT-OFF值指的是一個個判斷某一次測定定結(jié)果的由由陰性和陽性性對照信號值值按一定公公式計(jì)算出出來的信號值，每次測定定都會有所所差異。(1)CUT-OFF重復(fù)性驗(yàn)證證CUT-OFF的重復(fù)性（（同時包含含測定下限限的驗(yàn)證）批內(nèi)變異的的驗(yàn)證批間變異的的驗(yàn)證驗(yàn)證步驟制備足夠40次重復(fù)檢測測的3份樣本：分別為處于于臨界濃度度、高于臨臨界濃度20%和低于臨界界濃度20%的樣本。重復(fù)檢測樣樣本40次，確定每每一份樣本結(jié)果為陽性性和陰性的的百分比。。評價臨界濃濃度是否準(zhǔn)準(zhǔn)確？評價價+20至-20%的濃度范圍圍是否包含于、位位于或者超超出這種方方法的95%區(qū)間？CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuidelineC50是否準(zhǔn)確？40次測試C501陽性結(jié)果=<13/40(32.5%)不正確>=27/40(67.5%)2陽性結(jié)果（14-26）/40（35%-65%）正確陽性結(jié)果重復(fù)性檢測總次數(shù)次數(shù)百分比真正百分比樣本的實(shí)際濃度201050%30%-70%C30-C70402050%35%-65%1005050%40%-60%不同C50重復(fù)檢測次數(shù)數(shù)與檢出陽陽性數(shù)的關(guān)系系臨界點(diǎn)（CUT-OFF）的重復(fù)性指指的是什么？？是為正在評價的檢測試劑或系統(tǒng)建立分析物的的臨界濃度(C50)，并且確保臨臨界濃度±20%的范圍處于95%區(qū)間內(nèi)。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline如何獲得系統(tǒng)統(tǒng)或試劑的“臨界點(diǎn)”檢測試劑或系系統(tǒng)的說明書可能會會注明分析物物的臨界濃度度。如果臨界濃度度未知，則可以將陽性樣樣本進(jìn)行一系系列稀釋，然然后將他們進(jìn)進(jìn)行重復(fù)檢測測以確定能夠夠獲得50%陽性和50%陰性結(jié)果的那那個稀釋度。。這一稀釋度度的分析物濃濃度即為臨界點(diǎn)。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline(2)測定下限的驗(yàn)驗(yàn)證處于測定下限限濃度（如臨臨界點(diǎn)濃度+20%）的樣本，重重復(fù)檢測20次，應(yīng)至少有有18次以上(>90%)為陽性反應(yīng)。。重復(fù)性驗(yàn)證的的質(zhì)量控制質(zhì)控品：如方方法學(xué)比較在在10天內(nèi)完成，則每一批次都都要進(jìn)行質(zhì)控樣本檢測，如出現(xiàn)失控，，則當(dāng)次檢測測結(jié)果無效。。安排重新檢測以替換不不合格的批次次。實(shí)驗(yàn)室要要分析失控的原因。不不合格批次在在10天內(nèi)不應(yīng)超過1次或20天內(nèi)不超過兩兩次。如若超出，，所在實(shí)驗(yàn)室室應(yīng)中止檢測測工作并咨詢詢試劑制造商商以確定原因因并采取糾正正措施。得出20次重復(fù)檢測結(jié)果。如果方方法比較研究究超過20天，則每一批批次對每份對對照樣本進(jìn)行行單次檢測，，總計(jì)也提供供20次結(jié)果。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline6.其他（1）同一項(xiàng)目不不同檢測方法法或儀器的比比對適用范圍:一個項(xiàng)目有兩兩種以上的方方法或者兩臺臺以上的儀器器(包括同一型號號的儀器)同時檢測,需要進(jìn)行一致致性比對。（注：定量檢檢測中,報告單位不同同的不需要比比對）首次比對選取取40份(20)樣本,最好陰陽性各各半↓隨機(jī)每8份分成一組↓兩種方法(或兩臺儀器)每天平行檢測測一組樣本↓將所有檢測結(jié)結(jié)果匯總↓Kappa檢驗(yàn),評價一致性新鮮患者血清清陰性2例，，陽性3例，，陽性包含有有S/CO高高、中、低值值，用新舊批批號試劑檢測測。低值避開“灰灰區(qū)”夾心法：S/CO低值1.2－3競爭法：S/CO低值0.4－0.6判斷標(biāo)準(zhǔn)：符符合率為100%為可接接受。（2）更換批號的的簡易比對：：（3）編制性能驗(yàn)驗(yàn)證的SOP理想的操作方方法：操作中影響測測定結(jié)果的關(guān)關(guān)鍵環(huán)節(jié)已知知；具有可操作性性的SOP。怎樣編寫SOP？XXX單位XXX實(shí)驗(yàn)室XXX標(biāo)準(zhǔn)操作程序編號：啟用日期：版本：第頁共頁一目的：適用范圍：職責(zé)或責(zé)任人：（方法原理）（檢測設(shè)備和試劑）（所需的環(huán)境條件）操作步驟：

1．

2．

3．。。。。。八、本操作程序變動程序：九、相關(guān)的文件十、相關(guān)的記錄表格和報告編寫人審核人批準(zhǔn)人（4）試劑的性能能驗(yàn)證（定定性）重復(fù)性和準(zhǔn)確確性測定下限(Detectionlimit)（定性）批內(nèi)變異(<10%)和批間變異(<15-25%)“鉤狀”效應(yīng)(Hookeffect)變異體的檢測測能力(如：HBsAg)臨床敏感性和和特異性抗干擾能力三.性能驗(yàn)證的注注意事項(xiàng)1.方法比較持續(xù)時間10~20天。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline2.數(shù)據(jù)收集的檢檢查每次實(shí)驗(yàn)，應(yīng)應(yīng)立即記錄所所有原始檢測測數(shù)據(jù)并復(fù)核核，以早期發(fā)發(fā)現(xiàn)分析系統(tǒng)統(tǒng)及人為誤差差的來源。一旦發(fā)現(xiàn)某些些結(jié)果是由可可解釋的誤差差引起的，則則應(yīng)將其記錄錄下來，同時時，這些結(jié)果果不能用于數(shù)數(shù)據(jù)分析。如不能確定誤誤差產(chǎn)生的原原因，則保留留原始結(jié)果。3.不一致結(jié)果的的處理如果比較方法不是是100%準(zhǔn)確，可以用用“金標(biāo)準(zhǔn)”“參考方法”來檢測在檢測測和比較方法法間產(chǎn)生差異異的樣本。CLSIEP12-A2UserProtocolforEvaluationofQualitativeTestPerformance;ApprovedGuideline4.參考血清盤曾經(jīng)被檢測過過的、或者被被成熟方法檢測的，或臨床診診斷中有意義義的臨床樣本對于評價定性性方法來說很很有價值。陽性樣本濃度度高低不等，，具有代表性性。可占整個個血清盤樣本本數(shù)的50%。陰性樣本可含含有干擾物質(zhì)質(zhì)?？烧颊麄€個血清盤樣本本數(shù)的