人教版教學(xué)生物選修1之蛋白質(zhì)的提取和分離課件

人教版教學(xué)生物選修1之蛋白質(zhì)的提取和分離課件1血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)2課題3血紅蛋白的提取和分離專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題3血紅蛋白的提取和分離專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)3一、基礎(chǔ)知識:學(xué)生活動1:1、分離生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？3、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純？4、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗材料？5、用什么方法分離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)？一、基礎(chǔ)知識:學(xué)生活動1:1、分離生物大分子的基本思路是什4一、基礎(chǔ)知識--蛋白質(zhì)提取和分離原理

蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)－－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。提取分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法

一、基礎(chǔ)知識--蛋白質(zhì)提取和分離原理蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)5（1）原理：（2）材料大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。

(一)凝膠色譜法（1）原理：大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；多6（3）分離過程

混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。

(一)凝膠色譜法（3）分離過程混合物洗大分子流動快收集收集洗脫：從色7(一)凝膠色譜法(一)凝膠色譜法8㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、什么是凝膠？2、什么是凝膠色譜法？學(xué)生活動2:3、凝膠色譜法的原理是什么？4、請用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過程。㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、什么是凝膠？9人教版教學(xué)生物選修1之蛋白質(zhì)的提取和分離課件101、什么是緩沖液？2、緩沖液的作用是什么？學(xué)生活動3:3、緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過的人體血液的緩沖物質(zhì)有哪些？4、本實(shí)驗加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？（二）、緩沖溶液1、什么是緩沖液？2、緩沖液的作用是什么？學(xué)生活動3:311由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑組成：配制：作用：調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。（二）、緩沖溶液由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。緩沖溶液－－洗脫劑調(diào)節(jié)緩沖劑的121、什么是電泳？2、影響電泳遷移速度的因素有哪些？學(xué)生活動4:4、電泳分離各種分子的原理是什么？

（三）、電泳3、如何消除電荷對電泳遷移速度的影響？5、請描述電泳的過程？1、什么是電泳？2、影響電泳遷移速度的因素有哪些？學(xué)生活132．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動方向和運(yùn)動速度不同。

影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.2．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀14影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素

決定運(yùn)動方向形成庫侖力形成阻力決定運(yùn)動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素

決定形成形成決定電荷性質(zhì)電荷量15在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。（2）分離方法：（3）分離過程：

瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。(三)電泳在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；（2）分離方法：16電泳檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳17二、實(shí)驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。二、實(shí)驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：18（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放3、分離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：19樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白二、實(shí)驗操作樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成20血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素課題3血紅蛋白的提取與分離返回血液組成成分閱讀思考：血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2211.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色課題3血紅蛋白的提取與分離1.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？血液3g檸22采集得到雞血采集得到雞血23初次離心后的結(jié)果初次離心后的結(jié)果243次洗滌后的結(jié)果返回3次洗滌后的結(jié)果返回252.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？①目的分析：②蒸餾水的作用是______________________________。③加入甲苯的作用是____________________________。④充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂課題3血紅蛋白的提取與分離2.釋放血紅蛋白閱讀思考：①目的分析：使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶26(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原27磁力攪拌器返回磁力攪拌器返回283.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯課題3血紅蛋白的提取與分離3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞高速離心離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)29(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離30甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次返回甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色31課題3血紅蛋白的提取與分離4.透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL課題3血紅蛋白的提取與分離4.透析血紅蛋白20mmol/32利用透析袋透析利用透析袋透析33透析過程返回透析過程返回34課題3血紅蛋白的提取與分離純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫課題3血紅蛋白的提取與分離純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色35（二）凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。（二）凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米36裝配好的凝膠柱裝配好的凝膠柱37返回返回38材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:課題3血紅蛋白的提取與分離2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴

凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液課題39（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。②凝膠的前處理：配制凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。

2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠40④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm413.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)423.樣品的加入和洗脫3.樣品的加入和洗脫433.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞44收集得到的純化后的血紅蛋白收集得到的純化后的血紅蛋白45課題3血紅蛋白的提取與分離注意事項1.紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。為什么？課題3血紅蛋白的提取與分離注意事項1.紅細(xì)胞的洗滌：46

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗結(jié)果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-147三、實(shí)驗結(jié)果分析與評價2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

三、實(shí)驗結(jié)果分析與評價2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？48

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？三、實(shí)驗結(jié)果分析與評價如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話49課題3血紅蛋白的提取與分離知識總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質(zhì)的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定課題3血紅蛋白的提取與分離知識總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋50 教學(xué)反饋1．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。A分子的大小B相對分子質(zhì)量的大小C帶電荷的多少D溶解度2．緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（）基本不變。A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動。A相同B相反C相對D相向4.哺乳動物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動蛋白D肌球蛋白BBBA 教學(xué)反饋1．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)515．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最多。A白細(xì)胞B血小板C紅細(xì)胞D淋巴細(xì)胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑（）。A.NaClB.甲苯C.蒸餾水D.檸檬酸鈉7．將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（）A無色透明的甲苯層B脂溶性物質(zhì)的沉淀層C血紅蛋白的水溶液D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物CDC5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最52練習(xí)鞏固1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D獲得高純度的蛋白質(zhì)練習(xí)鞏固1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越532、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無法比較2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的543、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調(diào)節(jié)pHB維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C防止微生物生長D防止血液凝固3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率555、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別是A4、2B4、4C2、1D、1、16、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機(jī)溶劑-----脂類物質(zhì)-----血紅蛋白溶液------紅細(xì)胞破碎物沉淀5、一分子血紅蛋白最多可攜帶的O2分子數(shù)和CO2分子數(shù)分別56人教版教學(xué)生物選修1之蛋白質(zhì)的提取和分離課件57血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)58課題3血紅蛋白的提取和分離專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題3血紅蛋白的提取和分離專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)59一、基礎(chǔ)知識:學(xué)生活動1:1、分離生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？3、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質(zhì)蛋白哪方面的差異進(jìn)行提純？4、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用人的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗材料？5、用什么方法分離相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)？一、基礎(chǔ)知識:學(xué)生活動1:1、分離生物大分子的基本思路是什60一、基礎(chǔ)知識--蛋白質(zhì)提取和分離原理

蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)－－蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別。提取分離方法凝膠色譜法

凝膠電泳法

一、基礎(chǔ)知識--蛋白質(zhì)提取和分離原理蛋白質(zhì)提取與分離的依據(jù)61（1）原理：（2）材料大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢。多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。

(一)凝膠色譜法（1）原理：大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；多62（3）分離過程

混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。

(一)凝膠色譜法（3）分離過程混合物洗大分子流動快收集收集洗脫：從色63(一)凝膠色譜法(一)凝膠色譜法64㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、什么是凝膠？2、什么是凝膠色譜法？學(xué)生活動2:3、凝膠色譜法的原理是什么？4、請用自己的話總結(jié)出凝膠色譜法分離相對分子質(zhì)量不同蛋白質(zhì)的具體過程。㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、什么是凝膠？65人教版教學(xué)生物選修1之蛋白質(zhì)的提取和分離課件661、什么是緩沖液？2、緩沖液的作用是什么？學(xué)生活動3:3、緩沖液是如何配制的？你所學(xué)過的人體血液的緩沖物質(zhì)有哪些？4、本實(shí)驗加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？（二）、緩沖溶液1、什么是緩沖液？2、緩沖液的作用是什么？學(xué)生活動3:367由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑組成：配制：作用：調(diào)節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pH的緩沖液。抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。（二）、緩沖溶液由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。緩沖溶液－－洗脫劑調(diào)節(jié)緩沖劑的681、什么是電泳？2、影響電泳遷移速度的因素有哪些？學(xué)生活動4:4、電泳分離各種分子的原理是什么？

（三）、電泳3、如何消除電荷對電泳遷移速度的影響？5、請描述電泳的過程？1、什么是電泳？2、影響電泳遷移速度的因素有哪些？學(xué)生活692．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運(yùn)動方向和運(yùn)動速度不同。

影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.2．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀70影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素

決定運(yùn)動方向形成庫侖力形成阻力決定運(yùn)動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動速度的因素

決定形成形成決定電荷性質(zhì)電荷量71在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。（2）分離方法：（3）分離過程：

瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。(三)電泳在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；（2）分離方法：72電泳檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳73二、實(shí)驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質(zhì)。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。二、實(shí)驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：74（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放3、分離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。（一）樣品處理1、紅細(xì)胞的洗滌：75樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白二、實(shí)驗操作樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成76血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素課題3血紅蛋白的提取與分離返回血液組成成分閱讀思考：血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2771.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒有黃色課題3血紅蛋白的提取與分離1.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？血液3g檸78采集得到雞血采集得到雞血79初次離心后的結(jié)果初次離心后的結(jié)果803次洗滌后的結(jié)果返回3次洗滌后的結(jié)果返回812.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？①目的分析：②蒸餾水的作用是______________________________。③加入甲苯的作用是____________________________。④充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂課題3血紅蛋白的提取與分離2.釋放血紅蛋白閱讀思考：①目的分析：使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶82(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原83磁力攪拌器返回磁力攪拌器返回843.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞混合液高速離心10min離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)燒杯課題3血紅蛋白的提取與分離3.分離血紅蛋白分離過程紅細(xì)胞高速離心離心管濾紙過濾脂類物質(zhì)85(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。(3)分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離86甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次返回甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色87課題3血紅蛋白的提取與分離4.透析血紅蛋白20mmol/L磷酸緩沖液1mL1mL課題3血紅蛋白的提取與分離4.透析血紅蛋白20mmol/88利用透析袋透析利用透析袋透析89透析過程返回透析過程返回90課題3血紅蛋白的提取與分離純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫課題3血紅蛋白的提取與分離純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色91（二）凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。（二）凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作：①取長40厘米92裝配好的凝膠柱裝配好的凝膠柱93返回返回94材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:課題3血紅蛋白的提取與分離2.凝膠色譜柱的裝填：步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴

凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液課題95（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。②凝膠的前處理：配制凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。

2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠96④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm973.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)983.樣品的加入和洗脫3.樣品的加入和洗脫993.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。3.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞100收集得到的純化后的血紅蛋白收集得到的純化后的血紅蛋白101課題3血紅蛋白的提取與分離注意事項1.紅細(xì)胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2.凝膠的預(yù)處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.色譜柱成功標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。為什么？課題3血紅蛋白的提取與分離注意事項1.紅細(xì)胞的洗滌：102

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗結(jié)果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-1103三、實(shí)驗結(jié)果分析與評價2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

三、實(shí)驗結(jié)果分析與評價2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？104

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？三、實(shí)驗結(jié)果分析與評價如