植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)

第十章植物細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!一、植物細(xì)胞培養(yǎng)：在一定條件下，通過人工供給營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子，使離體植物細(xì)胞生長繁殖的方法。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要用于研究細(xì)胞生長、發(fā)育與分化等理論以及用于植物次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!（一）細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)的特性：

1.植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大，具有纖維素細(xì)胞壁，抗剪切力差；2.細(xì)胞生長速度慢，易受微生物污染，有時需用抗生素；3.細(xì)胞生長的中期及對數(shù)期，易凝聚為直徑達(dá)350um一400um的團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較困難；4.培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強(qiáng)力通風(fēng)攪拌；并具有群體效應(yīng)5.培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，且產(chǎn)量較低，培養(yǎng)過程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!1植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!(5)植物激素:如生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸；其它有油菜素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸類:如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氯酸、蘇氨酸、酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤及胸腺嘧啶等；(8)其它成分:如氯化膽堿、膽質(zhì)素、膠氨酸、蘋果酸及反丁烯二酸等.2.培養(yǎng)基：

(1)固體培養(yǎng)基：添加瓊脂等

(2)液體培養(yǎng)基：不加瓊脂等植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!1.懸浮培養(yǎng)法：植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(cellsuspensionculture)即植物細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體在液體培養(yǎng)基中于搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，這些細(xì)胞和小的聚集體來自愈傷組織，某個器官或組織，甚至幼嫩的植株，通過物理或化學(xué)的方法進(jìn)行分離而獲得。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!(2)培養(yǎng)過程：

將愈傷組織、無菌苗、吸漲胚胎或外植體芽尖、根尖及葉肉組織，經(jīng)勻漿器破碎、紗布或不銹鋼網(wǎng)過濾，單細(xì)胞濾液作為按種材料，接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。(3)懸浮培養(yǎng)特點(diǎn)：

培養(yǎng)過程中細(xì)胞總數(shù)不斷增加，一定時間后產(chǎn)量達(dá)最高點(diǎn)，生長趨于停止。然后進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，其過程表現(xiàn)出嚴(yán)格可重復(fù)周期性變化，細(xì)胞增長規(guī)律與微生物相同，有延遲期、對數(shù)生長期、減慢期及靜止期等階段。植物細(xì)胞接種時要達(dá)到一定細(xì)胞濃度，通常為0.25xl0‘細(xì)胞／ml一0.5x10‘細(xì)胞／m1。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!B.連續(xù)培養(yǎng)(Continuousculture):

是用一定容積的非密閉系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使?fàn)I養(yǎng)物連續(xù)得到補(bǔ)充，細(xì)胞生長和增殖連續(xù)進(jìn)行，同時有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。最大特點(diǎn)是細(xì)胞生長速率標(biāo)準(zhǔn)一致，新形成的細(xì)胞補(bǔ)償了被排出的細(xì)胞，系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞密度、生長速度、化學(xué)成分、細(xì)胞代謝活性都維持恒定?？赏ㄟ^改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件建立恒定系統(tǒng)。恒化控制：通過營養(yǎng)液或某一成分恒濁控制：比濁計測定渾濁度而進(jìn)行流量控制。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!2.固相化培養(yǎng)技術(shù)：

細(xì)胞固定在一定的惰性基質(zhì)中，如瓊脂、海藻酸鹽、聚丙烯酰氨纖維膜上，細(xì)胞不能運(yùn)動，但營養(yǎng)液可以在基質(zhì)中流動。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!3.單細(xì)胞培養(yǎng)：對單離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的方法。（1）平板培養(yǎng)法：分散的植物細(xì)胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)過程稱為平板培養(yǎng)法。。方法是將經(jīng)機(jī)械破碎過篩或酶(纖維素酶及果膠酶等)消化分散的細(xì)胞，洗滌離心除酶，細(xì)胞濃縮物經(jīng)計數(shù)及稀釋，接種到加熱熔化而剛冷卻至35℃左有的固體培養(yǎng)基中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密封，于25℃含5％CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞即可生長成團(tuán)。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!（2）看護(hù)培養(yǎng)法：從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上用針或玻璃毛細(xì)管分離單細(xì)胞，每個細(xì)胞放在一個方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長的愈傷組織上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!（四）細(xì)胞培養(yǎng)過程：1.擇適宜的外植體；2.誘導(dǎo)疏松愈傷組織；3.選擇適宜的培養(yǎng)基；4.懸浮培養(yǎng)；5.懸浮細(xì)胞的繼代與選擇；6.懸浮細(xì)胞的同步化；7.懸浮愈傷組織形成及植株再生。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!

2．單細(xì)胞分離(1)愈傷組織的細(xì)胞計數(shù)：取1g幼嫩、新鮮的愈傷組織．以1：10(w／v)加入o．1％(w／v)的果膠酶(溶于培養(yǎng)液或0．6mol/L的甘露醇溶液中，pH3．5)。25℃，黑暗下靜置12—16小時，再用電磁攪拌器低速攪拌幾分鐘．即可獲的細(xì)胞懸浮液，然后用血球計數(shù)板計數(shù)。(2)單細(xì)胞的機(jī)械分離。稱取適量的愈傷組織，放入適量液體培養(yǎng)基的三角瓶在120r／分、25℃，黑暗下懸浮培養(yǎng)。(3)懸浮液過濾：愈傷組織塊在液體培養(yǎng)基中連續(xù)振蕩培養(yǎng)3周后，用大約100目的尼龍網(wǎng)過濾，經(jīng)過濾后可獲得95％左右的單細(xì)胞。(4)單細(xì)胞收集。過濾液用150r／分離心5分鐘鐘，收集單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!(3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的誘導(dǎo)：將離心管中近l／3的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物倒入三角瓶中，并根據(jù)所需要的起始密度補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞在120轉(zhuǎn)／分，25℃黑暗下培養(yǎng)。并定期計數(shù)細(xì)胞密度，計錄并繪制細(xì)胞生長曲線．4．細(xì)胞團(tuán)和愈傷組織的再形成及植核再生大約在懸浮培養(yǎng)2周后，將細(xì)胞分裂形成的小愈傷組織團(tuán)塊(直徑約1．5—2．5mm)及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上(Ms基本成分，附加0．3％酵母提取物，0．3％水解酪蛋白，10mg／LKT．0．4mg／LNAA及7．0％蔗糖)。連續(xù)光照，空溫25℃。3周后即可分化出試管苗。如果不及時轉(zhuǎn)移，愈傷組織團(tuán)塊很快失去分化能力，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后即停止生長，變褐，死亡。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!2.工藝過程：（1）培養(yǎng)基植物愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為Ms培養(yǎng)基，煙酸0.5mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2.0mg/l及蔗糖30g/l，pH5．6—pH5．8。（2）三七種質(zhì)材料選擇與處理取3—4年生三七植株粗根，用自來水充分洗凈．再用70％乙醇沖洗表面后切成小塊，在70％乙醇中浸泡2min再轉(zhuǎn)移至0．1％升汞溶液中浸泡20min然后用無菌水沖洗4—5次，備用。（3）愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng)：將上述無菌三七粗根小塊組織接種于含2mg/l的2，4—D、0.5mg/lKT及10％椰子乳的MS固體培養(yǎng)基中，于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40天，即可形成小的愈傷組織塊，然后每隔30天進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。每次繼代培養(yǎng)均取一塊愈傷組織，如此多次繼代培養(yǎng)即可獲得多個愈傷組織無性系。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!二、原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)：通過一定方法除去細(xì)胞壁，而得到一個裸露的植物細(xì)胞，即為原生質(zhì)體(Protoplast)。游離的原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)可以重新形成細(xì)胞壁，并像正常的植物細(xì)胞那樣具有全能性，經(jīng)過適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)可以再生出完整植株。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!自1970年首次獲得原生質(zhì)體再生植株成功以來，通過原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有280余種，其中有20種為我國首先報道。原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過程。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!（2）預(yù)處理：

A.預(yù)質(zhì)壁分離：17-20℃酶液中靜置半小時，再于28—34℃保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右，再浸于酶液中消化即可達(dá)到質(zhì)壁分離目的；

B.預(yù)培養(yǎng):將除去下表皮的葉片于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高；

C.暗處理:將室溫下生長5—7個星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力；

D.光處理:將葉片于日光或燈光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離；

E.低溫處理:夏季應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)材料其萌動種子應(yīng)于4℃過夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質(zhì)體培養(yǎng)效果較佳。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!常用的酶類有：A.纖維素酶，如OnozukaR—10及RS，國內(nèi)常用的為EA3—867，其中含少量果膠酶；B.果膠酶，如MacerozymeR—10又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過2％，作用時間長有毒害作用；此外亦用PectalyaseY—23，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為0．1％，懸浮細(xì)胞為0．05％；C.崩潰酶（Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；D.半纖維素酶，如RhozymeHP150，用于懸浮細(xì)胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細(xì)胞原生質(zhì)體的分離;E蝸牛酶，主要用于體細(xì)胞原生質(zhì)體分離。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!3．原生質(zhì)體分離及純化（1）分離：原生質(zhì)體分離有機(jī)械法及酶消化法，前者產(chǎn)量極低而不多用、后者又分—步法及二步法。一步法是將材料在2l一28℃用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理2—24h。二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細(xì)胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質(zhì)體。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)：1.培養(yǎng)方法：（1）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法，1.2%瓊脂,45oC.（2）液體培養(yǎng)：

A.淺層培養(yǎng)法:其過程是將1m1原生質(zhì)體懸液置于直徑4cm培養(yǎng)皿或25m1三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．初期振搖1—2次，防止粘壁；

B.懸滴培養(yǎng)法:其過程系將原生質(zhì)體懸液滴入培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，其量分別為5一10、50—100及100一200ul等，保持一定滴距．每皿由幾滴至十幾滴不等，培養(yǎng)皿加入濃度低于培養(yǎng)液的液體，再將皿蓋翻蓋于皿上并置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

C.雙層培養(yǎng)法:先將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻成層，再將原生質(zhì)體懸浮液置于已固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

D.看護(hù)培養(yǎng)法:在培養(yǎng)皿底層鋪一層正常密度且經(jīng)射線處理已失去分裂能力而有代謝活力的原生質(zhì)體瓊脂混合物作飼養(yǎng)層，再于其上接種一層低密度(5一lo個／細(xì)胞／m1)懸浮原生質(zhì)體培養(yǎng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!3.細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂：l一3天即再生新細(xì)胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓?？捎觅|(zhì)壁分離法或在稍微低滲溶液中出芽現(xiàn)象證實(shí)。也可用0.1%ST型或WBL型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細(xì)胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。經(jīng)后者染色，有細(xì)胞壁者發(fā)射綠色熒光。在原生質(zhì)培養(yǎng)過程中，胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細(xì)胞核周圍．常在1一2周內(nèi)發(fā)生次分裂。不同細(xì)胞分裂頻率不同，常在1％—90％之間。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!

5.植株再生除少數(shù)植物通過胚狀體直接發(fā)育成完整植株外，大多經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)分化形成芽及根再生為完整植株。當(dāng)愈傷組織達(dá)到1—2mm時，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于：(1)只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑；(2)與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細(xì)胞分裂素濃度高于生長素;(3)在誘導(dǎo)器官分化過程中，一般采用15001x左右的高光強(qiáng)。誘導(dǎo)器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。無根苗轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其只含低濃度生長素，而不含細(xì)胞分裂素，無根苗一旦生根即可發(fā)育成完整植株。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!特點(diǎn)：(1)可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配子不親合性；(2)可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質(zhì)雜種，且獲得的遺傳變異范圍極廣；(3)一次操作可實(shí)現(xiàn)兩個以上親本的融合作用(4)可獲得呈現(xiàn)雙親個體基因型總和的雜種；(5)可形成有性生殖障礙植物的種間雜種；植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!2、融合過程：23%-30%高密度混合2X105個/ml植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!3.影響融合的因素：PEG,高Ca2+高pH處理時間。4.雜種細(xì)胞的篩選：（1）遺傳互補(bǔ)篩選：（2）抗性互補(bǔ)篩選：（3）利用物理特性篩選：植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!(二)植物細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)基１.營養(yǎng)需求：

植物細(xì)胞生長所需營養(yǎng)較微生物細(xì)胞復(fù)雜，除水分外，其它營養(yǎng)成分可分為如下幾類：

(1)無機(jī)營養(yǎng):如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；

(2)維生素：如維生素B1、B6、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等；

(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；

(4)天然物:如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸薺汁、生梨汁及蘋果汁等；

植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!(三)植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中有懸浮培養(yǎng)、固相化培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)（微室培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)）等多種培養(yǎng)方式。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!(1)優(yōu)良的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必需滿足：

A.懸浮培養(yǎng)物分散性好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般由幾十個以下的細(xì)胞組成。B.均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。C.生長迅速，懸浮細(xì)胞的量一般2—3天甚至更短時間便可增加一。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!(4)懸浮培養(yǎng)類型：A.成批培養(yǎng)(Batchculture)：

成批培養(yǎng)是在一個封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞材料生長在已固定體積的培養(yǎng)基中。隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，培養(yǎng)基營養(yǎng)的消耗及某些其他因子的積累會使細(xì)胞停止生長。繼代培養(yǎng)需取出少量培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)液中。生長過程包括延遲期、指數(shù)期、靜止期等。分緩慢轉(zhuǎn)動培養(yǎng)（1-2rpm）、震蕩培養(yǎng)（100rpm）、快速轉(zhuǎn)動培養(yǎng)（80-120rpm）和攪拌培養(yǎng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!（1）固相化培養(yǎng)的特點(diǎn)：A.消除剪切力；B.細(xì)胞生長緩慢，促進(jìn)次生代謝過程；C.細(xì)胞之間緊密接觸，形成梯度，利于產(chǎn)物積累；D.便于操作，不易污染。E.便于產(chǎn)物收集。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!(2)固相化培養(yǎng)系統(tǒng)：A.平床培養(yǎng)：生長慢，代謝產(chǎn)物多，但不易放大。B.填充床培養(yǎng)：條件控制困難。C.膜生物反應(yīng)器：采用一定孔徑和選擇透性膜來固定營養(yǎng)物，營養(yǎng)物可以通過膜滲透到細(xì)胞中。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!（3）微室培養(yǎng)法：懸浮單細(xì)胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內(nèi)的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!水稻細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及植株再生：

1.愈傷組織的誘導(dǎo)：(1)取水稻種子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2分鐘，再用2．5％次氯酸鈉水溶液浸泡并輕輕攪動30分鐘。(2)將種子用無菌蒸餾水沖洗3次，按每瓶3粒接入附加2mg／L2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取物的Ms固體培養(yǎng)基中，25℃黑暗下培養(yǎng)、誘導(dǎo)愈傷組織。(3)3周后，將從胚部長出的愈傷組織切割，并轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每2周繼代1次。(4)挑選疏松、易碎的愈傷組織進(jìn)行繼代、增殖．植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!3.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：(1)計算細(xì)胞起始密度：離心后將2／3的上清液例掉，將剩余部分輕輕搖動，使細(xì)胞均勻懸浮，取1滴懸浮液滴于血球計數(shù)板上，以游離單細(xì)胞為基數(shù)，計算細(xì)胞密度。(2)測定細(xì)胞活力。酚藏花紅染色法和二醋酸熒光素染色法：先配制o．1％酚藏花紅水溶液，溶劑為培養(yǎng)液，二醋酸熒光素則先用丙酮配成5mg／ml貯藏備用，使用時用培養(yǎng)液稀釋為0.01%的溶液.將培養(yǎng)物和二醋酸熒光素溶液在載玻片上混合，再用o．1％酚藏花紅水溶液作染料，滴一滴于載玻片上，與上述溶液混合，蓋上蓋玻片。酚藏花紅能將死細(xì)胞染成紅色，很快可在顯微鏡下觀察，5—30分鐘后改用相差和熒光顯微鏡，活細(xì)胞顯示較強(qiáng)的熒光反應(yīng)。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!

三七細(xì)胞培養(yǎng)工藝：1.工藝流程：植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!

（4）．細(xì)胞懸浮培養(yǎng):培養(yǎng)基為含lmg/l2,4-D、0.05mg/lKT及l(fā)0％椰乳的MS培養(yǎng)基pH5.8。l00ml三角瓶的培養(yǎng)基裝量為25ml，高壓滅菌20min冷卻后按1-2g/L干重接種愈傷組織．愈傷組織切成干重1mg小塊。于25℃搖床中以120轉(zhuǎn)／分鐘振蕩培養(yǎng)30天，即得三七懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物。（5）三七細(xì)胞大量培養(yǎng)：培養(yǎng)基與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)相同。在l0L攪拌反應(yīng)器中加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)液充滿系數(shù)為0.75一0.80，滅菌后冷卻至室溫．接種已培養(yǎng)25—30天的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，接種量按干細(xì)胞計為1—2g/L，在25—26℃下，以60轉(zhuǎn)／分鐘攪拌速度及0．6vvm—o．8vvm(vvm為每分鐘單位體積培養(yǎng)液中通入空氣的體積數(shù))速度通氣，并維持pH5.5—5.8．培養(yǎng)30天，收獲細(xì)胞。（6）細(xì)胞收集及干燥：每批細(xì)胞培養(yǎng)30天后，離心或過濾收集細(xì)胞，用去離子水洗滌3次，每次抽干，然后于30一40℃低溫下真空干燥或凍干，即得三七培養(yǎng)細(xì)胞成品。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!A-E,培養(yǎng)的歐當(dāng)歸(LevisticumofficinaleKoch))原生質(zhì)體分裂再生成植株的過程F-L,培養(yǎng)過程的核變化；F.多核，G.核穿壁，H.無絲分裂，I.染色體橋，J.2n=22，K.L.多倍體.A-D當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv)Diels)原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗E-H,紅豆草(OnobrychisvicaefoliaScop))原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的：（1）利用原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁的特性可以進(jìn)行細(xì)胞器移植和外源物的攝取(病毒、微生物、外源遺傳物質(zhì))，原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞(即體細(xì)胞雜交）。（2）是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質(zhì)對植物原生質(zhì)體進(jìn)行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導(dǎo)分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。（3）也是研究細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體細(xì)胞無性系變異和植物病理學(xué)研究的有用工具。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!(一)原生質(zhì)體的制備：1、材料來源與預(yù)處理：（1）材料來源：

可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。

植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!2.制備原生質(zhì)體的酶類：高等植物細(xì)胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維素、果膠質(zhì)及蛋白質(zhì)。細(xì)胞生長的不同階段及不同物種的細(xì)胞壁組成與結(jié)構(gòu)不同，木質(zhì)化及次生加厚的細(xì)胞壁不被酶消化，故選擇消化細(xì)胞壁的酶類是制備原生質(zhì)體關(guān)鍵。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!酶液配制：

需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0.1mmol/l一10mo1／l)及KH2PO4(0.75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質(zhì)體完整性。酶液pH值相當(dāng)重要，纖維素酶及果膠酶單獨(dú)使用時，其pH分別以5.4及5.8為宜；混合使用時pH5.4-pH5.6為宜，降至4．8以下則原生質(zhì)體破裂。酶液配制后需以0.45um微孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!（3）純化需用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)(100目一400目)濾除較大雜物后再洗滌純化。

A.離心法:原生質(zhì)體混合物于500—l000rpm離心5min,吸去上層液，沉淀再用與酶液具有相同糖濃度溶液反復(fù)洗滌3一4次，最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌備用；B.飄浮法:離心法純化的原生質(zhì)體若含較多碎片及少量老細(xì)胞時．可用20％蔗糖離心，原生質(zhì)體浮于液面．碎片及老細(xì)胞沉降而得以純化，但產(chǎn)量低，有時對原生質(zhì)體造成損傷；C.界面法:利用高分子聚合物混合液產(chǎn)生兩相水溶液的原理，將原生質(zhì)體混合物置于葡聚糖及PEG混合液中離心，即可從兩相界面獲得高純度原生質(zhì)體；

D.滴洗法:原生質(zhì)體混合物置于孔徑8um濾器中，用洗液以l--2滴／秒速度自然過濾洗滌，其過程勿使濾干，洗至一定程度后，用原生質(zhì)體培養(yǎng)液混合備用。此法原生質(zhì)體破碎少。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!

4．原生質(zhì)體活力測定

純化的原生質(zhì)體需經(jīng)活力測定后方可用于培養(yǎng)．測定方法有；（1）根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力：來源于葉片的原生質(zhì)體，呈綠色及圓而鼓者為活原生質(zhì)體；來源于愈傷組織及懸浮細(xì)胞者，胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流及布朗運(yùn)動活躍者活力較高；（2）活體染色法：用0.1％酚番紅或伊文思藍(lán)染色、不著色者為活原生質(zhì)體，染色者為無活力原生質(zhì)體；（3）熒光染料活休染色法：用雙醋酸熒光素染色，染料可自由透過細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為熒光素，后者不能自由透過細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強(qiáng)度即可判斷原生質(zhì)體死活。植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!2.培養(yǎng)條件：

密度：平板培養(yǎng)103~104個/ml,液體培養(yǎng)104~105個/ml溫度：多數(shù)為25-28oC,少數(shù)16~37oC光照：500lx,18h或2800lx連續(xù)光照多數(shù)要求黑暗或弱光植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)共59頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!（4）愈傷組織形成及胚狀體形成原生質(zhì)體再生的細(xì)胞一旦開始分裂，就可能繼續(xù)生長：A形成細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織；B.形成胚狀體，再產(chǎn)生植株；C.