基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件

目的基因與運(yùn)載體結(jié)合基因工程基本操作過(guò)程目的基因與運(yùn)載體結(jié)合基因工程基本操作過(guò)程1基因工程（geneticengineering）又稱(chēng)基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。基因工程技術(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段?；蚬こ桃兀喊ㄍ庠碊NA，載體分子，工具酶和受體細(xì)胞等基因工程（geneticengineering）又稱(chēng)基因拼21.提取目的基因2.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）是基因工程的核心。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)切、接、轉(zhuǎn)、增、檢重組DNA技術(shù)的操作步驟：1.提取目的基因重組DNA技術(shù)的操作步驟：3基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件4

外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴(lài)于限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用.

基因重組:就是利用限制性?xún)?nèi)切酶及其他一些酶類(lèi)，切割和修飾載體DNA和目的基因．將兩者連接起來(lái)，將目的基因插入于可以自我復(fù)制的載體內(nèi)，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，以這種外源性的目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)得到擴(kuò)增或正確表達(dá)。外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體5依不同的研究目的而定，認(rèn)真設(shè)計(jì)最終構(gòu)建的重組體分子。需要考慮下列2個(gè)方面。如果研究目的是：(1)表達(dá)有價(jià)值的蛋白質(zhì)，要考慮選用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)序列和終止序列，要將目的基因置于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游，并審視“閱讀框”是否正確，這些對(duì)表達(dá)融合蛋白至關(guān)重要。(2)對(duì)某一基因的上游序列進(jìn)行調(diào)控機(jī)能分析，則需考慮選擇適當(dāng)?shù)膱?bào)告基因，并將可能具有調(diào)控機(jī)能的目的基因置于報(bào)告基因的上游適當(dāng)位置。若調(diào)控基因可能有增強(qiáng)子作用，還應(yīng)在報(bào)告基因下游適當(dāng)部位插入一個(gè)功能基因，由此反映增強(qiáng)子的作用。一、連接前的準(zhǔn)備依不同的研究目的而定，認(rèn)真設(shè)計(jì)最終構(gòu)建的重組體分子。需要考慮6基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件7為了將目的基因重組于載體分子之中，需要將載體DNA和目的基因分別進(jìn)行適當(dāng)處理，使其可以互相連接，形成新的重組分子。二、連接前的處理為了將目的基因重組于載體分子之中，需要將載體DNA和目的基因8載體DNA通常有著許多酶切位點(diǎn)．但是并不是所有的酶切位點(diǎn)都可用于重組切割，理想的酶切位點(diǎn)應(yīng)該符合下列幾個(gè)條件:1）位于載體上特定的酶切位點(diǎn)要盡可能少,最好是單一酶切位點(diǎn),這樣才能保證目的基因和載體DNA以最高的幾率正確組合.2）

在酶切位點(diǎn)之前要有一個(gè)較強(qiáng)的啟動(dòng)子，使插入的目的基因可在該啟動(dòng)子的指導(dǎo)下高效表達(dá)。3）選擇的載體必須在連接后對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中的編碼區(qū)讀框不改變。1.對(duì)載體的要求載體DNA通常有著許多酶切位點(diǎn)．但是并不是所有的酶切位點(diǎn)都可9當(dāng)載體和外源DNA用同樣的限制性?xún)?nèi)切酶切割時(shí)，所形成的DNA末端就能夠彼此相匹配，可以被T4連接酶共價(jià)地連接起來(lái)，形成重組體分子。但是,當(dāng)靶片段的末端與載體不匹配時(shí)，必須轉(zhuǎn)換其中一個(gè)或兩個(gè)片段的末端形式以便使之連接。這種末端的轉(zhuǎn)換通常用以下三種方式轉(zhuǎn)換：①

3’凹端補(bǔ)平：使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平3’凹端，將不匹配的3‘凹端轉(zhuǎn)換為粘端；或者完全補(bǔ)平，產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA相連接。

②3’突端切除：T4噬菌體DNA聚合酶具有強(qiáng)烈的3’-5’外切核酸酶活性，可將3’突端切除。

③平端加上人工合成接頭：合成接頭是自相互補(bǔ)的兩個(gè)化學(xué)合成的寡核苷酸的等摩爾混合物，而兩個(gè)寡聚體可形成帶一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的平端雙鏈體。因此在平端DNA加接頭可為其亞克隆操作增加一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。2、連接前的處理：末端的轉(zhuǎn)換2、連接前的處理：末端的轉(zhuǎn)換10載體DNA和目的基因DNA的連接,按DNA片段末端性質(zhì)不同，可有下述不同的連接方法：①粘性末端連接法

②平端連接法③同聚物加尾連接法④人工接頭連接法三．基因與載體的連接4種方法載體DNA和目的基因DNA的連接,按DNA片段末端性質(zhì)不同，111.同一限制酶切位點(diǎn)連接:由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端和酶切位點(diǎn)附近的DNA序列不影響連接.在連接酶的作用下即可形成重組DNA分子.

上述方法的缺點(diǎn)：由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)中常發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。解決方法：用細(xì)菌的堿性磷酸酶預(yù)先處理線(xiàn)性的載體DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。（一）粘性末端DNA片段的連接

1.同一限制酶切位點(diǎn)連接:（一）粘性末端DNA片段的連接12基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件132.不同限制酶切位點(diǎn)連接:由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段、具有相同類(lèi)型的粘性末端，彼此稱(chēng)為互補(bǔ)末端也可以采用粘性末端連接。外源DNA和載體DNA經(jīng)過(guò)兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶切割后一側(cè)產(chǎn)生的黏性末端，另一側(cè)產(chǎn)生平未端（可先生成黏性末端再補(bǔ)平）。2.不同限制酶切位點(diǎn)連接:14基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件15雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點(diǎn)外源DNA只能以一個(gè)方向定向插入到重組質(zhì)粒中，以便目的基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。載體與外源DNA結(jié)合處的限制酶切位點(diǎn)仍然保留，可以隨時(shí)從重組載體中通過(guò)相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶切割后分離獲得目的基因。不會(huì)自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌克隆大多數(shù)攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒。雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點(diǎn)外源DNA只能以一個(gè)方向定向插入到16

一些內(nèi)切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割產(chǎn)生DNA的片段沒(méi)有粘性末端，而是平末端。具有平末端的酶切載體只能與平末端的目的基因連接。T4DNA連接酶可催化相同或不相同的限制性?xún)?nèi)切酶切割的平端間的連接。平端連接比粘性末端連接要困難的多，其連接效率很低，約有粘性末端連接的1%。適用于限制性?xún)?nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端適用于粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端

（二）平端連接一些內(nèi)切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割產(chǎn)生DNA17基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件18提高平頭末端連接效率的方法包括：

①加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）②加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)；③加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用；④加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl）。提高平頭末端連接效率的方法包括：19

當(dāng)載體和外源DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)之間，不可能找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r(shí)，解決方法：

⑴人工接頭連接法：通過(guò)依次加入、連接合成DNA接頭，再用限制酶切加以解決。

⑵同聚物加尾連接法：可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體酶切位點(diǎn)處和外源DNA片段的3’端加上相互補(bǔ)的同聚尾加以解決。⑶PCR法：通過(guò)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)擴(kuò)增外源DNA片段，從而加上合適的限制性?xún)?nèi)切酶的單一識(shí)別序列，再用限制酶切加以解決。

當(dāng)載體和外源DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)之間，不可能找到恰當(dāng)20同聚物加尾連接：利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸。dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下,連接成為重組的DNA。這種方法可適用于任何來(lái)源的DNA片段。但方法較繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用。（三）同聚物加尾法（三）同聚物加尾法21基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件22同聚物接尾法實(shí)際上是一種人工粘性末端連接法。優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)DNA加尾，既可以使兩個(gè)具平末端的DNA片段進(jìn)行連接，也可以使具平末端的DNA片段與粘性末端的DNA片段進(jìn)行連接。

缺點(diǎn)：只對(duì)質(zhì)粒載體有效；質(zhì)粒和cDNA上的同聚物長(zhǎng)度難以控制相等，影響克隆效率；用其轉(zhuǎn)化宿主菌的效率依不同菌株而有較大差異。同聚物接尾法實(shí)際上是一種人工粘性末端連接法。23人工接頭（DNA寡核苷酸連桿）是人工合成的具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙股平端DNA短序列。由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。（四）人工接頭連接法人工接頭（DNA寡核苷酸連桿）是人工合成的具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定24基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件25優(yōu)點(diǎn)：是進(jìn)行DNA重組的一種既有效又實(shí)用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端連接法的優(yōu)點(diǎn)，而且它可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求，設(shè)計(jì)出具有不同限制酶位點(diǎn)的人工接頭。若在體外連接反應(yīng)中增加人工接頭的濃度，還會(huì)大大提高平末端DNA片段間的連接效率。缺點(diǎn)：如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的人工接頭相同的限制酶切位點(diǎn)，這樣在酶切消化人工接頭產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的外源基因切成不同的片段，從而為后繼的操作造成麻煩。優(yōu)點(diǎn)：是進(jìn)行DNA重組的一種既有效又實(shí)用的手段，兼具有同聚物26自從1973年Jackson等人在一次分子生物學(xué)學(xué)會(huì)上首次提出基因可以人工重組，并能在細(xì)菌中復(fù)制。從此以后，基因工程成為一項(xiàng)新興的研究領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展，無(wú)論是基礎(chǔ)研究，還是應(yīng)用研究均取得了喜人的成果。這是生命科學(xué)發(fā)展的一次飛躍，生命科學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)定向、快速改造生物性狀的新時(shí)代，受到了國(guó)內(nèi)外廣泛的重視。開(kāi)展基因工程研究幾十年來(lái)，建立了多種分別適用于微生物、動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的載體受體系統(tǒng)，克隆出了一批有用的目的基因，研制出了數(shù)十種昂貴的基因工程藥物，培育出了一批具有特殊性狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物?；蚬こ坛晒鹤詮?973年Jackson等人在一次分子生物學(xué)學(xué)會(huì)27基因工程在20世紀(jì)取得了很大的進(jìn)展，至少有兩個(gè)有力的證明。一是轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物，一是克隆技術(shù)。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物由于植入了新的基因，使得動(dòng)植物具有了原先沒(méi)有的全新的性狀，這引起了一場(chǎng)農(nóng)業(yè)革命。如今，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始廣泛應(yīng)用，如抗蟲(chóng)西紅柿、生長(zhǎng)迅速的鯽魚(yú)等。1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的誕生。這只叫“多利”母綿羊是第一只通過(guò)無(wú)性繁殖產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物，它完全秉承了給予它細(xì)胞核的那只母羊的遺傳基因?！翱寺　币粫r(shí)間成為人們注目的焦點(diǎn)。盡管有著倫理和社會(huì)方面的憂(yōu)慮，但生物技術(shù)的巨大進(jìn)步使人類(lèi)對(duì)未來(lái)的想象有了更廣闊的空間?；蚬こ淘?0世紀(jì)取得了很大的進(jìn)展，至少有兩個(gè)有力的證明。一28基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件29當(dāng)今，國(guó)際上一項(xiàng)合作性的基因組測(cè)序計(jì)劃的完成。隨著功能性基因不斷被開(kāi)發(fā)出，分離及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，轉(zhuǎn)基因獲表達(dá)效率不斷提高，21世紀(jì)基因工程研究將會(huì)有更大的發(fā)展。人類(lèi)將因?yàn)橛辛嘶蚬こ虝?huì)使壽命大大延長(zhǎng)；生物的多樣性將得到維護(hù)并發(fā)展……?？茖W(xué)家們紛紛發(fā)表文章稱(chēng)“基因工程，前景誘人”，但出現(xiàn)的問(wèn)題也是極其復(fù)雜的，關(guān)系到人類(lèi)自身的安全，包括我們生存的環(huán)境，種族的延續(xù)，甚至倫理道德。所以，在實(shí)施該工程時(shí)，必須把好審批關(guān)，從嚴(yán)掌握，避免失誤。基因工程發(fā)展：當(dāng)今，國(guó)際上一項(xiàng)合作性的基因組測(cè)序計(jì)劃的完成。30謝謝歡迎批評(píng)指正基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件31目的基因與運(yùn)載體結(jié)合基因工程基本操作過(guò)程目的基因與運(yùn)載體結(jié)合基因工程基本操作過(guò)程32基因工程（geneticengineering）又稱(chēng)基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。基因工程技術(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。基因工程要素：包括外源DNA，載體分子，工具酶和受體細(xì)胞等基因工程（geneticengineering）又稱(chēng)基因拼331.提取目的基因2.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）是基因工程的核心。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)切、接、轉(zhuǎn)、增、檢重組DNA技術(shù)的操作步驟：1.提取目的基因重組DNA技術(shù)的操作步驟：34基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件35

外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴(lài)于限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用.

基因重組:就是利用限制性?xún)?nèi)切酶及其他一些酶類(lèi)，切割和修飾載體DNA和目的基因．將兩者連接起來(lái)，將目的基因插入于可以自我復(fù)制的載體內(nèi)，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，以這種外源性的目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)得到擴(kuò)增或正確表達(dá)。外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體36依不同的研究目的而定，認(rèn)真設(shè)計(jì)最終構(gòu)建的重組體分子。需要考慮下列2個(gè)方面。如果研究目的是：(1)表達(dá)有價(jià)值的蛋白質(zhì)，要考慮選用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)節(jié)序列和終止序列，要將目的基因置于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游，并審視“閱讀框”是否正確，這些對(duì)表達(dá)融合蛋白至關(guān)重要。(2)對(duì)某一基因的上游序列進(jìn)行調(diào)控機(jī)能分析，則需考慮選擇適當(dāng)?shù)膱?bào)告基因，并將可能具有調(diào)控機(jī)能的目的基因置于報(bào)告基因的上游適當(dāng)位置。若調(diào)控基因可能有增強(qiáng)子作用，還應(yīng)在報(bào)告基因下游適當(dāng)部位插入一個(gè)功能基因，由此反映增強(qiáng)子的作用。一、連接前的準(zhǔn)備依不同的研究目的而定，認(rèn)真設(shè)計(jì)最終構(gòu)建的重組體分子。需要考慮37基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件38為了將目的基因重組于載體分子之中，需要將載體DNA和目的基因分別進(jìn)行適當(dāng)處理，使其可以互相連接，形成新的重組分子。二、連接前的處理為了將目的基因重組于載體分子之中，需要將載體DNA和目的基因39載體DNA通常有著許多酶切位點(diǎn)．但是并不是所有的酶切位點(diǎn)都可用于重組切割，理想的酶切位點(diǎn)應(yīng)該符合下列幾個(gè)條件:1）位于載體上特定的酶切位點(diǎn)要盡可能少,最好是單一酶切位點(diǎn),這樣才能保證目的基因和載體DNA以最高的幾率正確組合.2）

在酶切位點(diǎn)之前要有一個(gè)較強(qiáng)的啟動(dòng)子，使插入的目的基因可在該啟動(dòng)子的指導(dǎo)下高效表達(dá)。3）選擇的載體必須在連接后對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中的編碼區(qū)讀框不改變。1.對(duì)載體的要求載體DNA通常有著許多酶切位點(diǎn)．但是并不是所有的酶切位點(diǎn)都可40當(dāng)載體和外源DNA用同樣的限制性?xún)?nèi)切酶切割時(shí)，所形成的DNA末端就能夠彼此相匹配，可以被T4連接酶共價(jià)地連接起來(lái)，形成重組體分子。但是,當(dāng)靶片段的末端與載體不匹配時(shí)，必須轉(zhuǎn)換其中一個(gè)或兩個(gè)片段的末端形式以便使之連接。這種末端的轉(zhuǎn)換通常用以下三種方式轉(zhuǎn)換：①

3’凹端補(bǔ)平：使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平3’凹端，將不匹配的3‘凹端轉(zhuǎn)換為粘端；或者完全補(bǔ)平，產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA相連接。

②3’突端切除：T4噬菌體DNA聚合酶具有強(qiáng)烈的3’-5’外切核酸酶活性，可將3’突端切除。

③平端加上人工合成接頭：合成接頭是自相互補(bǔ)的兩個(gè)化學(xué)合成的寡核苷酸的等摩爾混合物，而兩個(gè)寡聚體可形成帶一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的平端雙鏈體。因此在平端DNA加接頭可為其亞克隆操作增加一個(gè)或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。2、連接前的處理：末端的轉(zhuǎn)換2、連接前的處理：末端的轉(zhuǎn)換41載體DNA和目的基因DNA的連接,按DNA片段末端性質(zhì)不同，可有下述不同的連接方法：①粘性末端連接法

②平端連接法③同聚物加尾連接法④人工接頭連接法三．基因與載體的連接4種方法載體DNA和目的基因DNA的連接,按DNA片段末端性質(zhì)不同，421.同一限制酶切位點(diǎn)連接:由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端和酶切位點(diǎn)附近的DNA序列不影響連接.在連接酶的作用下即可形成重組DNA分子.

上述方法的缺點(diǎn)：由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)中常發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。解決方法：用細(xì)菌的堿性磷酸酶預(yù)先處理線(xiàn)性的載體DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。（一）粘性末端DNA片段的連接

1.同一限制酶切位點(diǎn)連接:（一）粘性末端DNA片段的連接43基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件442.不同限制酶切位點(diǎn)連接:由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段、具有相同類(lèi)型的粘性末端，彼此稱(chēng)為互補(bǔ)末端也可以采用粘性末端連接。外源DNA和載體DNA經(jīng)過(guò)兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶切割后一側(cè)產(chǎn)生的黏性末端，另一側(cè)產(chǎn)生平未端（可先生成黏性末端再補(bǔ)平）。2.不同限制酶切位點(diǎn)連接:45基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件46雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點(diǎn)外源DNA只能以一個(gè)方向定向插入到重組質(zhì)粒中，以便目的基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。載體與外源DNA結(jié)合處的限制酶切位點(diǎn)仍然保留，可以隨時(shí)從重組載體中通過(guò)相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶切割后分離獲得目的基因。不會(huì)自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌克隆大多數(shù)攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒。雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點(diǎn)外源DNA只能以一個(gè)方向定向插入到47

一些內(nèi)切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割產(chǎn)生DNA的片段沒(méi)有粘性末端，而是平末端。具有平末端的酶切載體只能與平末端的目的基因連接。T4DNA連接酶可催化相同或不相同的限制性?xún)?nèi)切酶切割的平端間的連接。平端連接比粘性末端連接要困難的多，其連接效率很低，約有粘性末端連接的1%。適用于限制性?xún)?nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端適用于粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端

（二）平端連接一些內(nèi)切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割產(chǎn)生DNA48基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件49提高平頭末端連接效率的方法包括：

①加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）②加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)；③加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用；④加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl）。提高平頭末端連接效率的方法包括：50

當(dāng)載體和外源DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)之間，不可能找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r(shí)，解決方法：

⑴人工接頭連接法：通過(guò)依次加入、連接合成DNA接頭，再用限制酶切加以解決。

⑵同聚物加尾連接法：可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體酶切位點(diǎn)處和外源DNA片段的3’端加上相互補(bǔ)的同聚尾加以解決。⑶PCR法：通過(guò)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)擴(kuò)增外源DNA片段，從而加上合適的限制性?xún)?nèi)切酶的單一識(shí)別序列，再用限制酶切加以解決。

當(dāng)載體和外源DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)之間，不可能找到恰當(dāng)51同聚物加尾連接：利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸。dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下,連接成為重組的DNA。這種方法可適用于任何來(lái)源的DNA片段。但方法較繁，需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用。（三）同聚物加尾法（三）同聚物加尾法52基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件53同聚物接尾法實(shí)際上是一種人工粘性末端連接法。優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)DNA加尾，既可以使兩個(gè)具平末端的DNA片段進(jìn)行連接，也可以使具平末端的DNA片段與粘性末端的DNA片段進(jìn)行連接。

缺點(diǎn)：只對(duì)質(zhì)粒載體有效；質(zhì)粒和cDNA上的同聚物長(zhǎng)度難以控制相等，影響克隆效率；用其轉(zhuǎn)化宿主菌的效率依不同菌株而有較大差異。同聚物接尾法實(shí)際上是一種人工粘性末端連接法。54人工接頭（DNA寡核苷酸連桿）是人工合成的具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙股平端DNA短序列。由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。（四）人工接頭連接法人工接頭（DNA寡核苷酸連桿）是人工合成的具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定55基因工程基本操作過(guò)程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合)課件56優(yōu)點(diǎn)：是進(jìn)行DNA重組的一種既有效又實(shí)用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端連接法的優(yōu)點(diǎn)，而且它可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求，設(shè)計(jì)出具有不同限制酶位點(diǎn)的人工接頭。若在體外連接反應(yīng)中增加人工接頭的濃度，還會(huì)大大提高平末端DNA片段間的連接效率。缺點(diǎn)：如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的人工接頭相同的限制酶切位點(diǎn)，這樣在酶切消化人工接頭產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，