第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程課件

第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程第一節(jié)生物工程概述第二節(jié)基因工程第三節(jié)蛋白質(zhì)工程第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程第一節(jié)生物工程概述第二節(jié)1第一節(jié)生物工程概述一、生物工程概念及研究技術(shù)二、在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應用第一節(jié)生物工程概述一、生物工程概念及研究技術(shù)二、在現(xiàn)代工2一、生物工程的概念及研究技術(shù)1.基因工程——在分子水平的遺傳操作技術(shù)2.細胞工程——遺傳物質(zhì)在細胞間的轉(zhuǎn)移4.生化工程——生物工程產(chǎn)品的最終取得手段3.酶工程——酶的改造和設(shè)計一、生物工程的概念及研究技術(shù)1.基因工程——在分子水平的遺傳3二、生物工程在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應用1.化工及冶金工業(yè)2.輕工和食品工業(yè)4.農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)3.醫(yī)藥工業(yè)5.環(huán)保和能源工業(yè)二、生物工程在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應用1.化工及冶金工業(yè)24基因工程包括DNA重組技術(shù)和其他使基因結(jié)構(gòu)得以定向改造的技術(shù)。本節(jié)主要介紹DNA重組技術(shù)，大體上包括下列5個步驟。基因工程包括DNA重組技術(shù)和其他使基因結(jié)構(gòu)得以定向改造5DNA重組的技術(shù)路線

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmolecule

Introductionintohostcellsbytransformation

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的制備

2、載體的構(gòu)建

3、目的基因與載體的重組

4、重組體導入宿主細胞進行擴增

5、克隆基因的鑒定DNA重組的技術(shù)路線

ForeignDNAtobe6第二節(jié)基因工程一、目的基因的獲得二、基因載體三、重組DNA的篩選及表達第二節(jié)基因工程一、目的基因的獲得二、基因載體三、重組DN7一、目的基因的獲得1.限制酶——特異性切割DNA的手術(shù)刀2.取得目的基因的方法——分離法及合成法一、目的基因的獲得1.限制酶——特異性切割DNA的手術(shù)刀2.81.

限制性內(nèi)切酶

DNA重組即是將兩種DNA分子經(jīng)過切割，選擇適合的片段連接起來的過程實現(xiàn)這一步，是在限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以后才實現(xiàn)的

限制性內(nèi)切酶：一類核酸內(nèi)切酶，可以將外源DNA在特定位點切割降解。以后從細菌中分別分離出了I型和Ⅱ型兩類限制性內(nèi)切酶。

1.限制性內(nèi)切酶

DNA重組即是將兩9限制性內(nèi)切酶的命名

用細菌同名的第一個字母（大寫）和種名的前兩個字母（小寫）構(gòu)成酶的基本名稱。若酶是從其中一種特殊菌株來，還在基本名稱后加上菌株名稱符號。名稱后的羅馬數(shù)字，表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。如HaeII是從（Haemophilusaegypticus）中提取的，并且是從中發(fā)現(xiàn)的第二個酶。限制性內(nèi)切酶的命名用細菌同名的第一個字母（10限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式

a.從識別序列的中間切開b.在識別序列對稱軸的左右兩方進行切割

c.在識別序列對稱軸的右邊（5’-3’鏈）和對稱軸左邊（3’-5’鏈）切開

限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式a.從識別序列的中間切開11a.從識別序列的中間切開

從識別序列的中間切開產(chǎn)生平齊末端（bluntends），

如HaeⅢ

a.從識別序列的中間切開從識別序列的中間切開產(chǎn)生平齊末端（12b.在識別序列對稱軸的左右兩方進行切割

即分別在5’-3’鏈和3’-5’鏈對稱軸的左右方切開，形成帶有凸出的5’磷酸基團的粘性末端（Cohesiveends），如EcoRⅠb.在識別序列對稱軸的左右兩方進行切割即分別在5’-313c.在識別序列對稱軸的右邊（5’-3’鏈）和對稱軸左邊（3’-5’鏈）切開形成帶有凸出的3’羥基的粘性末端，如pstIc.在識別序列對稱軸的右邊（5’-3’鏈）和對稱軸左邊（3’142.取得目的基因的方法

——分離法及合成法（1）DNA片段的直接提?。?）用噬菌體或質(zhì)粒直接從宿主細胞中將目的基因攜出（3）使用相應的mRNA分離基因2.取得目的基因的方法

15二、基因載體1.質(zhì)?！旧w以外的遺傳單元2.噬菌體——感染細菌的病毒二、基因載體1.質(zhì)?！旧w以外的遺傳單元2.噬菌體——感16

質(zhì)粒是一種環(huán)狀雙鏈的DNA分子。自身在細菌細胞中能不斷復制繁殖。研究比較深入的質(zhì)粒有大腸桿菌的性因子（F因子）、大腸桿菌素因子和抗藥因子等

抗藥因子（質(zhì)粒）在其DNA上編碼有某些酶的基因，表達產(chǎn)生的酶對鏈霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四環(huán)素、卡那霉素等藥物能產(chǎn)生生物化學修飾，使之鈍化而失效1.質(zhì)粒——染色體以外的遺傳單元質(zhì)粒是一種環(huán)狀雙鏈的DNA分子。自身在細菌細胞17質(zhì)粒的作用質(zhì)粒DNA能從細菌中提出來，又能再轉(zhuǎn)入細菌。這個過程稱轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA仍能進行復制，這種性能為DNA重組技術(shù)提供了重要的條件，即將一種外源基因與質(zhì)粒重組后，再轉(zhuǎn)入細菌中去復制繁殖，使外源基因得以增殖。質(zhì)粒自身的某些抗藥基因成為從轉(zhuǎn)化的細菌中篩選它們的一種標記。除質(zhì)粒外，噬菌體、病毒也能通過“感染”將外源基因帶入細菌并進行復制。質(zhì)粒的作用質(zhì)粒DNA能從細菌中提出來，又能再轉(zhuǎn)18目前所使用的質(zhì)粒

目前實驗中所使用的質(zhì)粒、噬菌體和病毒載體種類很多。但都是經(jīng)過了人工改造，更適宜運用于DNA重組技術(shù)。它們既保留了轉(zhuǎn)化和感染活細胞的能力，又具有多處攜帶外源DNA的酶切位點，并含有特殊的篩選標記這些載體中有些只能復制擴增帶入的外源基因；有些可以使外源基因復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯出基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這種載體稱為表達載體目前所使用的質(zhì)粒目前實驗中所使用的質(zhì)粒、噬菌體19pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

20

以噬菌體或病毒為載體，將所需基因或含有此基因的DNA片段轉(zhuǎn)移給受體細胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導。我們常常采用噬菌體作為基因工程的載體，其一它的遺傳結(jié)構(gòu)與功能知道得比較清楚；其二是易于使細胞感染，易于使外源DNA導入宿主細胞。2.噬菌體——感染細菌的病毒以噬菌體或病毒為載體，將所需基因或含有此基因的21以噬菌體為載體進行DNA克隆

DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝頭部前體多聯(lián)體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細胞內(nèi)進行DNA的裝配過程以噬菌體為載體進行DNA克隆

DNA用限制性內(nèi)切酶除去中22三、重組DNA的篩選及表達1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入受體細胞2.篩選——從大量受體細胞選出帶有重組體的細胞3.表達——外源DNA在受體細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯三、重組DNA的篩選及表達1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入231.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入受體細胞由質(zhì)粒作載體形成的克隆，轉(zhuǎn)入細菌時細菌預先要在低溫條件下用氯化鈣處理，形成“感受態(tài)”細胞。即增加細胞膜的通透性才能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由噬菌體作載體的克隆，轉(zhuǎn)入細胞的過程稱為“侵染”。因噬菌體具有自動侵入的功能。細菌不用預先處理。

1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入受體細胞由質(zhì)24噬菌體感染大腸桿菌的途徑

噬菌體感染大腸桿菌的途徑

25第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程課件262.篩選——從大量受體細胞選出帶有重組體的細胞（1）插入失活法（2）放射性探針檢測法（3）R-環(huán)檢測法（4）免疫測定法2.篩選——從大量受體細胞選出帶有重組體（1）插入失活法（227（1）插入失活法在現(xiàn)在的基因工程操作中，所使用的載體通常是經(jīng)過加工改造的衍生物，它們要么帶有一個或幾個可供選擇的遺傳標記，要么具有被選擇的遺傳功能，這就使帶有目的基因與不帶目的基因的細菌有明顯區(qū)別，便于篩選。（1）插入失活法在現(xiàn)在的基因工程操作中，所使用的載體通28pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素29（2）放射性探針檢測法利用mRNA可與相應的DNA段落雜交，來檢測有外源DNA插入的重組體，是一種快速而靈敏的方法。（2）放射性探針檢測法利用mRNA可與相應的DNA段落30第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程課件31（3）R-環(huán)檢測法在有利于形成R-環(huán)的條件下，使待檢測的純化的質(zhì)粒DNA，在含有mRNA的緩沖液中局部變性。如若質(zhì)粒DNA存在著與mRNA探針互補的序列，mRNA就會取代DNA中一條鏈，與另一條鏈形成雙鏈雜交分子，從而形成R-環(huán)結(jié)構(gòu)，在電子顯微鏡下觀察，可直接觀察到R-環(huán)。這樣可檢出重組體質(zhì)粒DNA。（3）R-環(huán)檢測法在有利于形成R-環(huán)的條件下，使待檢測32（4）免疫測定法免疫法測定只能是所轉(zhuǎn)移外源DNA必須表達后才能進行，而且必須具備有效的特異性抗體。（4）免疫測定法免疫法測定只能是所轉(zhuǎn)移外源DNA必須表達后才33第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程課件34Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiographySouthern和Western印跡法DNA353.表達——外源DNA在受體細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯

帶有目的基因的載體轉(zhuǎn)移到受體細胞成功并篩選出來后，最終目的是要目的基因在受體細胞中得以表達，產(chǎn)生具有功能性的蛋白質(zhì)或肽。

3.表達——外源DNA在受體細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯帶有36第三節(jié)蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程的概念二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)三、蛋白質(zhì)工程的應用第三節(jié)蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程的概念二、蛋白質(zhì)工程的一般37一、蛋白質(zhì)工程的概念

蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)：通過改造與蛋白質(zhì)相應的基因中的堿基順序，或設(shè)計合成新的基因，將它克隆至受體細胞中，通過基因表達而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)技術(shù)1、基因定點突變——定做新蛋白質(zhì)2、蛋白質(zhì)設(shè)計——對天然蛋白質(zhì)的修飾一、蛋白質(zhì)工程的概念1、基因定點突變——定做新蛋白質(zhì)38蛋白質(zhì)工程舉例：定點突變技術(shù)：已知絲氨酸是由TCT編碼，只要把C改為G，就變成半胱氨酸的密碼TGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里含有TGT外，其余均與基因部分互補。打開含有被突變蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒的雙條鏈成單鏈模板，用引物與之互補鏈退火（假如退火在適宜溫度下進行，約15個堿基中，有一個堿基錯配是可以容忍的）。然后由DNA聚合酶延伸引物，由DNA連接酶將雙鏈再連接成環(huán)，轉(zhuǎn)入宿主細胞復制，即產(chǎn)生兩種子代質(zhì)粒。一半的順序中含有TCT順序，另一半含有TGT順序。表達具有TGT順序的質(zhì)粒，即可以產(chǎn)生在同一部位上半胱氨酸代替絲氨酸的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)工程舉例：定點突變技術(shù)：39二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)1、蛋白質(zhì)工程的理論設(shè)計——蛋白質(zhì)工程的前提2、點突變法——基因修飾的方法（1）基因的全化學合成（2）基因直接修飾法（3）盒式突變技術(shù)二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)40三、蛋白質(zhì)工程的應用1、蛋白質(zhì)工程酶—酶特性的改造（1）改變酶的催化活性（2）改變酶的底物專一性（3）提高酶的穩(wěn)定性（4）酶的反應特性改變（5）產(chǎn)生新酶2、合理藥物設(shè)計—蛋白質(zhì)工程用于新藥研制譬如：胰島素原的人工合成三、蛋白質(zhì)工程的應用41胰島素原的人工合成

胰臟(A)n胰島素原mRNAcDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌mRNA反轉(zhuǎn)錄酶胰島素原基因與質(zhì)粒連接感染E.coli胰島素原胰島素原的人工合成

胰臟(A)ncDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌mR42TheEnd謝謝觀賞TheEnd43GameOver！GameOver！44第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程第一節(jié)生物工程概述第二節(jié)基因工程第三節(jié)蛋白質(zhì)工程第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程第一節(jié)生物工程概述第二節(jié)45第一節(jié)生物工程概述一、生物工程概念及研究技術(shù)二、在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應用第一節(jié)生物工程概述一、生物工程概念及研究技術(shù)二、在現(xiàn)代工46一、生物工程的概念及研究技術(shù)1.基因工程——在分子水平的遺傳操作技術(shù)2.細胞工程——遺傳物質(zhì)在細胞間的轉(zhuǎn)移4.生化工程——生物工程產(chǎn)品的最終取得手段3.酶工程——酶的改造和設(shè)計一、生物工程的概念及研究技術(shù)1.基因工程——在分子水平的遺傳47二、生物工程在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應用1.化工及冶金工業(yè)2.輕工和食品工業(yè)4.農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)3.醫(yī)藥工業(yè)5.環(huán)保和能源工業(yè)二、生物工程在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應用1.化工及冶金工業(yè)248基因工程包括DNA重組技術(shù)和其他使基因結(jié)構(gòu)得以定向改造的技術(shù)。本節(jié)主要介紹DNA重組技術(shù)，大體上包括下列5個步驟?；蚬こ贪―NA重組技術(shù)和其他使基因結(jié)構(gòu)得以定向改造49DNA重組的技術(shù)路線

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmolecule

Introductionintohostcellsbytransformation

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的制備

2、載體的構(gòu)建

3、目的基因與載體的重組

4、重組體導入宿主細胞進行擴增

5、克隆基因的鑒定DNA重組的技術(shù)路線

ForeignDNAtobe50第二節(jié)基因工程一、目的基因的獲得二、基因載體三、重組DNA的篩選及表達第二節(jié)基因工程一、目的基因的獲得二、基因載體三、重組DN51一、目的基因的獲得1.限制酶——特異性切割DNA的手術(shù)刀2.取得目的基因的方法——分離法及合成法一、目的基因的獲得1.限制酶——特異性切割DNA的手術(shù)刀2.521.

限制性內(nèi)切酶

DNA重組即是將兩種DNA分子經(jīng)過切割，選擇適合的片段連接起來的過程實現(xiàn)這一步，是在限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以后才實現(xiàn)的

限制性內(nèi)切酶：一類核酸內(nèi)切酶，可以將外源DNA在特定位點切割降解。以后從細菌中分別分離出了I型和Ⅱ型兩類限制性內(nèi)切酶。

1.限制性內(nèi)切酶

DNA重組即是將兩53限制性內(nèi)切酶的命名

用細菌同名的第一個字母（大寫）和種名的前兩個字母（小寫）構(gòu)成酶的基本名稱。若酶是從其中一種特殊菌株來，還在基本名稱后加上菌株名稱符號。名稱后的羅馬數(shù)字，表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。如HaeII是從（Haemophilusaegypticus）中提取的，并且是從中發(fā)現(xiàn)的第二個酶。限制性內(nèi)切酶的命名用細菌同名的第一個字母（54限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式

a.從識別序列的中間切開b.在識別序列對稱軸的左右兩方進行切割

c.在識別序列對稱軸的右邊（5’-3’鏈）和對稱軸左邊（3’-5’鏈）切開

限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式a.從識別序列的中間切開55a.從識別序列的中間切開

從識別序列的中間切開產(chǎn)生平齊末端（bluntends），

如HaeⅢ

a.從識別序列的中間切開從識別序列的中間切開產(chǎn)生平齊末端（56b.在識別序列對稱軸的左右兩方進行切割

即分別在5’-3’鏈和3’-5’鏈對稱軸的左右方切開，形成帶有凸出的5’磷酸基團的粘性末端（Cohesiveends），如EcoRⅠb.在識別序列對稱軸的左右兩方進行切割即分別在5’-357c.在識別序列對稱軸的右邊（5’-3’鏈）和對稱軸左邊（3’-5’鏈）切開形成帶有凸出的3’羥基的粘性末端，如pstIc.在識別序列對稱軸的右邊（5’-3’鏈）和對稱軸左邊（3’582.取得目的基因的方法

——分離法及合成法（1）DNA片段的直接提?。?）用噬菌體或質(zhì)粒直接從宿主細胞中將目的基因攜出（3）使用相應的mRNA分離基因2.取得目的基因的方法

59二、基因載體1.質(zhì)?！旧w以外的遺傳單元2.噬菌體——感染細菌的病毒二、基因載體1.質(zhì)粒——染色體以外的遺傳單元2.噬菌體——感60

質(zhì)粒是一種環(huán)狀雙鏈的DNA分子。自身在細菌細胞中能不斷復制繁殖。研究比較深入的質(zhì)粒有大腸桿菌的性因子（F因子）、大腸桿菌素因子和抗藥因子等

抗藥因子（質(zhì)粒）在其DNA上編碼有某些酶的基因，表達產(chǎn)生的酶對鏈霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四環(huán)素、卡那霉素等藥物能產(chǎn)生生物化學修飾，使之鈍化而失效1.質(zhì)?！旧w以外的遺傳單元質(zhì)粒是一種環(huán)狀雙鏈的DNA分子。自身在細菌細胞61質(zhì)粒的作用質(zhì)粒DNA能從細菌中提出來，又能再轉(zhuǎn)入細菌。這個過程稱轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA仍能進行復制，這種性能為DNA重組技術(shù)提供了重要的條件，即將一種外源基因與質(zhì)粒重組后，再轉(zhuǎn)入細菌中去復制繁殖，使外源基因得以增殖。質(zhì)粒自身的某些抗藥基因成為從轉(zhuǎn)化的細菌中篩選它們的一種標記。除質(zhì)粒外，噬菌體、病毒也能通過“感染”將外源基因帶入細菌并進行復制。質(zhì)粒的作用質(zhì)粒DNA能從細菌中提出來，又能再轉(zhuǎn)62目前所使用的質(zhì)粒

目前實驗中所使用的質(zhì)粒、噬菌體和病毒載體種類很多。但都是經(jīng)過了人工改造，更適宜運用于DNA重組技術(shù)。它們既保留了轉(zhuǎn)化和感染活細胞的能力，又具有多處攜帶外源DNA的酶切位點，并含有特殊的篩選標記這些載體中有些只能復制擴增帶入的外源基因；有些可以使外源基因復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯出基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這種載體稱為表達載體目前所使用的質(zhì)粒目前實驗中所使用的質(zhì)粒、噬菌體63pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

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以噬菌體或病毒為載體，將所需基因或含有此基因的DNA片段轉(zhuǎn)移給受體細胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導。我們常常采用噬菌體作為基因工程的載體，其一它的遺傳結(jié)構(gòu)與功能知道得比較清楚；其二是易于使細胞感染，易于使外源DNA導入宿主細胞。2.噬菌體——感染細菌的病毒以噬菌體或病毒為載體，將所需基因或含有此基因的65以噬菌體為載體進行DNA克隆

DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝頭部前體多聯(lián)體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細胞內(nèi)進行DNA的裝配過程以噬菌體為載體進行DNA克隆

DNA用限制性內(nèi)切酶除去中66三、重組DNA的篩選及表達1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入受體細胞2.篩選——從大量受體細胞選出帶有重組體的細胞3.表達——外源DNA在受體細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯三、重組DNA的篩選及表達1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入671.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入受體細胞由質(zhì)粒作載體形成的克隆，轉(zhuǎn)入細菌時細菌預先要在低溫條件下用氯化鈣處理，形成“感受態(tài)”細胞。即增加細胞膜的通透性才能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由噬菌體作載體的克隆，轉(zhuǎn)入細胞的過程稱為“侵染”。因噬菌體具有自動侵入的功能。細菌不用預先處理。

1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進入受體細胞由質(zhì)68噬菌體感染大腸桿菌的途徑

噬菌體感染大腸桿菌的途徑

69第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程課件702.篩選——從大量受體細胞選出帶有重組體的細胞（1）插入失活法（2）放射性探針檢測法（3）R-環(huán)檢測法（4）免疫測定法2.篩選——從大量受體細胞選出帶有重組體（1）插入失活法（271（1）插入失活法在現(xiàn)在的基因工程操作中，所使用的載體通常是經(jīng)過加工改造的衍生物，它們要么帶有一個或幾個可供選擇的遺傳標記，要么具有被選擇的遺傳功能，這就使帶有目的基因與不帶目的基因的細菌有明顯區(qū)別，便于篩選。（1）插入失活法在現(xiàn)在的基因工程操作中，所使用的載體通72pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素73（2）放射性探針檢測法利用mRNA可與相應的DNA段落雜交，來檢測有外源DNA插入的重組體，是一種快速而靈敏的方法。（2）放射性探針檢測法利用mRNA可與相應的DNA段落74第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程課件75（3）R-環(huán)檢測法在有利于形成R-環(huán)的條件下，使待檢測的純化的質(zhì)粒DNA，在含有mRNA的緩沖液中局部變性。如若質(zhì)粒DNA存在著與mRNA探針互補的序列，mRNA就會取代DNA中一條鏈，與另一條鏈形成雙鏈雜交分子，從而形成R-環(huán)結(jié)構(gòu)，在電子顯微鏡下觀察，可直接觀察到R-環(huán)。這樣可檢出重組體質(zhì)粒DNA。（3）R-環(huán)檢測法在有利于形成R-環(huán)的條件下，使待檢測76（4）免疫測定法免疫法測定只能是所轉(zhuǎn)移外源DNA必須表達后才能進行，而且必須具備有效的特異性抗體。（4）免疫測定法免疫法測定只能是所轉(zhuǎn)移外源DNA必須表達后才77第十二章基因工程與蛋白質(zhì)工程課件78Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecific