分子診斷技術(同名233)課件

分子診斷技術

1分子診斷技術

1常見的核酸分子診斷技術核酸分子雜交

(NucleicacidmolecularHybridization)基因芯片（GeneChip）聚合酶鏈反應(polymerasechainreactionreaction；PCR)2常見的核酸分子診斷技術2核酸分子雜交的原理雙鏈核酸加熱或經(jīng)鹼處理變性后，可解鏈成兩條互補的單鏈核酸。在適當溫度、鹽濃度下，雙鏈能按鹼基互補配對原則(A-T,C-G)復性而重新成為雙鏈核酸。用已知序列的單鏈核酸，經(jīng)標記制成核酸探針，與變性后的待測標本核酸進行雜交，通過檢測標記探針的信號，可判斷標本是否存在與探針互補雜交的同源核酸。3核酸分子雜交的原理雙鏈核酸加熱或經(jīng)鹼處理變性后，可解鏈成兩條核酸分子雜交探針的制備制備探針的靶核酸可通過:分離、切割病毒的特定核酸片段獲得;用重組技術，將該片段克隆到細菌質(zhì)粒，經(jīng)擴增和純化大量獲得;選擇已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸，其長度以20個左右最為常用，過短易出現(xiàn)非特異性雜交。4核酸分子雜交探針的制備制備探針的靶核酸可通過:4核酸分子雜交探針的制備常見的用于標記探針的示蹤物質(zhì)放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，雜交后可通過放射自顯影技術進行檢測非放射性物質(zhì)如：生物素、地高辛和酶等，雜交后可通過底物顯色、化學發(fā)光等技術進行檢測5核酸分子雜交探針的制備5

核酸分子雜交示意圖核酸分子雜交的程序

6

核酸分子雜交示意圖核酸分子雜交的程序6常用的核酸分子雜交技術斑點雜交（spotblothybridization）凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交（Southern

blothybridization)原位雜交（in-situhybridization）7常用的核酸分子雜交技術7斑點雜交DotBoltHybridizationforHBVDNAQuantitationin5μlofPatientSera8斑點雜交DotBoltHybridizationfor

凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交原位雜交

(Southernblothybridization)(in-situhybridization）9

凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交原核酸分子雜交技術的應用核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，因而該技術在分子生物學領域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性等在醫(yī)學上，目前已用于多種遺傳性疾病的基因診斷，惡性腫瘤的基因分析，傳染病病原體的檢測等領域中。10核酸分子雜交技術的應用核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特基因芯片基因芯片（或DNAChip,或Microarray）又稱DNA微陣列，是指固定在固相載體上的高密度DNA微點陣。即將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（點與點間距一般小于500μm）排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片。上圖顯示大量的DNA探針，按照一定的規(guī)律有序地排列在支撐物上，每個探針與相對應的特異互補序列結(jié)合后，即可發(fā)出熒光。利用該芯片可同時獲取大量信息。DNAMicroarray11基因芯片基因芯片（或DNAChip,或Microarray基因芯片技術原理大規(guī)模集成的固相雜交

基本原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補配對、變性和復性的原理

以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達的信息12基因芯片技術原理大規(guī)模集成的固相雜交以大量已知序列的寡核苷基因芯片的作用原理13基因芯片的作用原理13基因芯片的制作方式原位合成直接點樣原位光蝕刻合成原位噴印合成

分子印章法針式點樣噴墨點樣光導原位合成法14基因芯片的制作方式原位合成直接點樣原位光蝕刻合成原位噴印合成基因芯片技術流程15基因芯片技術流程15基因芯片的應用基因表達分析

分析基因表達時空特征基因差異表達檢測發(fā)現(xiàn)新基因大規(guī)模DNA測序基因型、基因突變和多態(tài)性分析疾病的診斷與治療

遺傳病相關基因的定位腫瘤診斷感染性疾病的診斷耐藥菌株和藥敏檢測16基因芯片的應用基因表達分析16聚合酶鏈反應

(polymerasechainreactionreaction；PCR)PCR是八十年代中期問世的一種體外模擬體內(nèi)DNA復制過程的技術，可在短時間內(nèi)將待測特異性DNA擴增百萬倍以上，并具有簡單、快速、特異的特點，成為分子生物學發(fā)展史的又一個里程碑。PCR不僅可檢測各種DNA病毒的核酸，還可經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，檢測各種RNA病毒的核酸，因而在各型肝炎病毒的檢測中，敏感性遠超過分子雜交，有著不可替代的作用。17聚合酶鏈反應

(polymerasechainreact

PCR的常見類型常規(guī)PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）巢式PCR〔nested-PCR〕原位PCR（in-situPCR）多重PCR…非對稱PCR免疫PCR定量PCR隨機引物PCR簡并引物PCR錨定PCR18

PCR的常見類型非對稱PCR18實時熒光定量PCR熒光檢測技術SYBRGreenI。是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。

TaqMan水解探針。由產(chǎn)熒光基團，熒光淬滅基團，與擴增子有互補的特異核苷酸序列組成。19實時熒光定量PCR熒光檢測技術19實時熒光定量PCR：水解探針法退火延伸切割聚合完成該法也稱TaqMan技術，在PCR系統(tǒng)中，加入能和靶核酸模板雜交的探針，其5’端帶有熒光報告基團，發(fā)射的熒光被3’端帶有的熒光淬滅基團所吸收。引物延伸時，由于聚合酶具有的5’→3’‘核酸外切酶作用，可把熒光報告基團從探針上切下，因與淬滅基團遠離，發(fā)出的熒光不被淬滅，隨模板擴增和游離熒光報告基團的增加而增強，并和初始靶核酸的量呈正相關。20實時熒光定量PCR：水解探針法該法也稱TaqMan技術，在PTaqMan法應用起始模板的定量基因型分析目的基因定量產(chǎn)物鑒定單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析21TaqMan法應用起始模板的定量21ThinkYou

22ThinkYou22分子診斷技術

23分子診斷技術

1常見的核酸分子診斷技術核酸分子雜交

(NucleicacidmolecularHybridization)基因芯片（GeneChip）聚合酶鏈反應(polymerasechainreactionreaction；PCR)24常見的核酸分子診斷技術2核酸分子雜交的原理雙鏈核酸加熱或經(jīng)鹼處理變性后，可解鏈成兩條互補的單鏈核酸。在適當溫度、鹽濃度下，雙鏈能按鹼基互補配對原則(A-T,C-G)復性而重新成為雙鏈核酸。用已知序列的單鏈核酸，經(jīng)標記制成核酸探針，與變性后的待測標本核酸進行雜交，通過檢測標記探針的信號，可判斷標本是否存在與探針互補雜交的同源核酸。25核酸分子雜交的原理雙鏈核酸加熱或經(jīng)鹼處理變性后，可解鏈成兩條核酸分子雜交探針的制備制備探針的靶核酸可通過:分離、切割病毒的特定核酸片段獲得;用重組技術，將該片段克隆到細菌質(zhì)粒，經(jīng)擴增和純化大量獲得;選擇已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸，其長度以20個左右最為常用，過短易出現(xiàn)非特異性雜交。26核酸分子雜交探針的制備制備探針的靶核酸可通過:4核酸分子雜交探針的制備常見的用于標記探針的示蹤物質(zhì)放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，雜交后可通過放射自顯影技術進行檢測非放射性物質(zhì)如：生物素、地高辛和酶等，雜交后可通過底物顯色、化學發(fā)光等技術進行檢測27核酸分子雜交探針的制備5

核酸分子雜交示意圖核酸分子雜交的程序

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核酸分子雜交示意圖核酸分子雜交的程序6常用的核酸分子雜交技術斑點雜交（spotblothybridization）凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交（Southern

blothybridization)原位雜交（in-situhybridization）29常用的核酸分子雜交技術7斑點雜交DotBoltHybridizationforHBVDNAQuantitationin5μlofPatientSera30斑點雜交DotBoltHybridizationfor

凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交原位雜交

(Southernblothybridization)(in-situhybridization）31

凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交原核酸分子雜交技術的應用核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性，因而該技術在分子生物學領域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性等在醫(yī)學上，目前已用于多種遺傳性疾病的基因診斷，惡性腫瘤的基因分析，傳染病病原體的檢測等領域中。32核酸分子雜交技術的應用核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特基因芯片基因芯片（或DNAChip,或Microarray）又稱DNA微陣列，是指固定在固相載體上的高密度DNA微點陣。即將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（點與點間距一般小于500μm）排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片。上圖顯示大量的DNA探針，按照一定的規(guī)律有序地排列在支撐物上，每個探針與相對應的特異互補序列結(jié)合后，即可發(fā)出熒光。利用該芯片可同時獲取大量信息。DNAMicroarray33基因芯片基因芯片（或DNAChip,或Microarray基因芯片技術原理大規(guī)模集成的固相雜交

基本原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補配對、變性和復性的原理

以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達的信息34基因芯片技術原理大規(guī)模集成的固相雜交以大量已知序列的寡核苷基因芯片的作用原理35基因芯片的作用原理13基因芯片的制作方式原位合成直接點樣原位光蝕刻合成原位噴印合成

分子印章法針式點樣噴墨點樣光導原位合成法36基因芯片的制作方式原位合成直接點樣原位光蝕刻合成原位噴印合成基因芯片技術流程37基因芯片技術流程15基因芯片的應用基因表達分析

分析基因表達時空特征基因差異表達檢測發(fā)現(xiàn)新基因大規(guī)模DNA測序基因型、基因突變和多態(tài)性分析疾病的診斷與治療

遺傳病相關基因的定位腫瘤診斷感染性疾病的診斷耐藥菌株和藥敏檢測38基因芯片的應用基因表達分析16聚合酶鏈反應

(polymerasechainreactionreaction；PCR)PCR是八十年代中期問世的一種體外模擬體內(nèi)DNA復制過程的技術，可在短時間內(nèi)將待測特異性DNA擴增百萬倍以上，并具有簡單、快速、特異的特點，成為分子生物學發(fā)展史的又一個里程碑。PCR不僅可檢測各種DNA病毒的核酸，還可經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，檢測各種RNA病毒的核酸，因而在各型肝炎病毒的檢測中，敏感性遠超過分子雜交，有著不可替代的作用。39聚合酶鏈反應

(polymerasechainreact

PCR的常見類型常規(guī)PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）巢式PCR〔nested-PCR〕原位PCR（in-situPCR）多重PCR…非對稱PCR免疫PCR定量PCR隨機引物PCR簡并引物PCR錨定PCR40

PCR的常見類型非對稱PCR18實時熒光定量PCR熒光檢測技術SYBRGreenI。是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。

TaqMan水解探針。由產(chǎn)熒光基團，熒光淬滅基團，與擴增子有互補的特異核苷酸序列組成。41實時熒光定量PCR熒光檢測技術19實時熒光定量PCR：水解探針法退火延伸切割聚合完成該法也稱TaqMan技術，在PCR系統(tǒng)中，加入能和靶核酸模