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第三章、離子化方法思考題:樣品分子為什么首先要離子化才能進(jìn)行質(zhì)譜分析?樣品分子電離是質(zhì)譜測定的必要條件。只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點和難點。第三章、離子化方法思考題:1第一節(jié)、電子轟擊離子化是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即M+eM+。+2e式中M為待測分子,M+。為分子離子或母體離子。第一節(jié)、電子轟擊離子化是通用的電離法,是使用高能2Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectronPrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometrye–Atomormoleculeishitbyhig3Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectron
electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculee–PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryAtomormoleculeishitbyhig4Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectron
electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculee–PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryAtomormoleculeishitbyhig5Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryThisenergy-richspecieseject6Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry
formingapositivelycharged,odd-electronspeciescalledthemolecularione–+
?Thisenergy-richspecieseject7formingapositivelycharged,odd-electronspeciescalledthemolecularionFengZhou,WenqingShui,YuLu,PengyuanYang*,andYinlongGuo*Somemoleculesundergoverylittlefragmentation只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。2mg/mL,(B)0.細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜(單張圖譜)Broadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scan第四節(jié)、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)MALDIAccessory-benchmarkdataelectronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculeUbiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute若m1>m2,則v1<v2間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖為什么APCI比較適合和LC、CE聯(lián)用?Delay(Pulsed)Extraction一、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)YuLu,FengZhou,WenqingShui,LipingBian,YinlongGuoandPengyuanYang*X-Ypositioningstage+cameraIR(CO2激光器):適用于高分子聚合物、DNA等TargetplateThemoleculariondissociatestoacation
andaradical.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry+
?formingapositivelycharged,8 20 40 60 80 100 120m/zm/z=78100806040200Relative
intensitySomemoleculesundergoverylittlefragmentation
Benzeneisanexample.Themajorpeakcorrespondstothemolecularion. 20 40 60 80 100 120m/zm/z=9離子化方法課件10思考題:1.EI的應(yīng)用范圍2.EI的特點使用最廣泛,譜庫最完整;電離效率高;結(jié)構(gòu)簡單,操作方便;分子離子峰強度較弱或不出現(xiàn)(因電離能量最高)。3.EI中通常的能量為多少?轟擊電子能量改變對質(zhì)譜的影響有哪些?4.為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會出現(xiàn)MH+,而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。5.EI適用于何種質(zhì)量分析器?思考題:11離子化方法課件12離子化方法課件13離子化方法課件14第二節(jié)、化學(xué)電離離子化
一、化學(xué)電離離子
二、自身化學(xué)電離離子化第二節(jié)、化學(xué)電離離子化
一、化學(xué)電離離子
15一、化學(xué)電離離子化(ChemicalIonization,CI)
化學(xué)電離源一般在1.3102~1.3103Pa。通過離子
-分子反應(yīng)來進(jìn)行。試劑氣通常為甲烷CH4。首先用高能電子,使CH4電離產(chǎn)生CH5+和C2H5+,即:CH4+eCH4+·+2eCH4+·CH3++H·CH4+·和CH3+很快與大量存在的CH4分子起反應(yīng),即:CH4+·+CH4CH5++CH3·
CH3++CH4C2H5++H2小量樣品(試樣與甲烷之比為11000)導(dǎo)入離子源,試樣分子(SH)發(fā)生下列反應(yīng):CH5++SHSH2++CH4
C2H5++SHS++C2H6SH2+和S+然后可能碎裂,產(chǎn)生質(zhì)譜。一、化學(xué)電離離子化(ChemicalIonization,16PCI甲烷反應(yīng)機理CH4e-HCH3CH4CH4+?CH3+MMM-H+CH5+CH3?CH4M+H+230eVPCI甲烷反應(yīng)機理CH4e-HCH3CH4CH4+?CH317離子化方法課件18三、大氣壓激光解吸離子化CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometrytransferoptics含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute[DHB+2Na-H]+形成單電荷離子對質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響?表面原子數(shù)量多,表面活性高,碳納米管可以很好的分散樣品分子,來防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemolecule二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化(Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即Solventchargetransferredtoanalytes使用最廣泛,譜庫最完整;MALDI-TOF,DHBEI適用于何種質(zhì)量分析器?三、大氣壓激光解吸離子化(AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI)可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用,所以脂肪鏈越長,信號越好,比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。2,5-二羥基苯甲酸(DHB)MultipoleionguidePCI三、大氣壓激光解吸離子化PCI19NCISpectraNCISpectra20思考題:1.什么情況下需要采用CI?2.CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?3.CI的用途4.比較CI和EI的靈敏度5.CI實現(xiàn)準(zhǔn)確質(zhì)量測定是否容易?6.CI的局限性思考題:21二、自身化學(xué)電離離子化(Self-chemicalionization,SCI)FTMS和離子阱的內(nèi)離子源中出現(xiàn)的特殊方法。樣品分子本身在電子轟擊時產(chǎn)生CH5+、C2H5+、C3H7+等可提供質(zhì)子的碎片離子,通過增加離子在阱中的運動時間,提高它們和分子的碰撞幾率,提高M(jìn)H+的強度,以實現(xiàn)CI。二、自身化學(xué)電離離子化(Self-chemicalioni22紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖23離子化方法課件24離子化方法課件25乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫檢索結(jié)果
乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫檢索結(jié)果26烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖
烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖27離子化方法課件28第二節(jié)、化學(xué)電離離子化離子源內(nèi)真空度高對分析什么樣品有利?2,5-二羥基苯甲酸(DHB)MALDI-TOFMS工作原理保護樣品,基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品,避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解;IR(CO2激光器):適用于高分子聚合物、DNA等CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?離子源內(nèi)真空度高對分析什么樣品有利?CH3++CH4C2H5++H2屬于粒子誘導(dǎo)離子化(particleinducedionization),采用高能中型粒子(Ar)轟擊樣品典型的間歇電噴霧的總離子流圖添加金屬離子(如:NaCl、KCl、AgNO3)的目的?含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即[M+CH3CO]+/[CH3CO+]典型的間歇電噴霧的總離子流圖PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點和難點。1Million!Somemoleculesundergoverylittlefragmentation--低質(zhì)量區(qū)會有基質(zhì)信號的背景干擾典型的間歇電噴霧的總離子流圖第二節(jié)、化學(xué)電離離子化(b)連續(xù)電噴霧的方法獲得的質(zhì)譜圖,信噪比的平均值為14.MALDI-TOF,DHB[Leu+2Na-H]+間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖保護樣品,基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品,避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解;二甲苯三個異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對強度只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。Broadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scanIR(CO2激光器):適用于高分子聚合物、DNA等Conditions:離子源內(nèi)真空度高對分析什么樣品有利?為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會出現(xiàn)MH+,而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。SCOUT100MALDIAccessory荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生Specification:PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryMALDIAccessory-benchmarkdata--低質(zhì)量區(qū)會有基質(zhì)信號的背景干擾(一)nanospray思考題:1.FTMS中SCI的特點?和CI相比有哪些優(yōu)勢?2.離子源內(nèi)真空度高對分析什么樣品有利?3.MH+的強度和哪些因素有關(guān)?4.應(yīng)用范圍第二節(jié)、化學(xué)電離離子化典型的間歇電噴霧的總離子流圖思考題:29間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖
間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜30
二甲苯三個異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對強度
[M+H]+/CH3COH+CH3[M+CH3CO]+/[CH3CO+]間二甲苯11.361.54對二甲苯1.930.425鄰二甲苯0.348二甲苯三個異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相31第三節(jié)、快原子轟擊離子化(Fastatombombardment,FAB)屬于粒子誘導(dǎo)離子化(particleinducedionization),采用高能中型粒子(Ar)轟擊樣品常用底物:G甘油NBA間硝基芐醇
第三節(jié)、快原子轟擊離子化(Fastatombombard32離子化方法課件33離子化方法課件34思考題:1.FAB和CI相比有何特點?2.添加金屬離子(如:NaCl、KCl、AgNO3)的目的?3.與活潑氫可以可以發(fā)生反應(yīng)的樣品是否可以進(jìn)行FAB測定?4.為什么在送FAB測試樣品時需要溶解性的信息?5.FAB適用于什么類型樣品?思考題:35第四節(jié)、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)一、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化(Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)三、大氣壓激光解吸離子化(AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI)第四節(jié)、激光解吸離子化(LaserDesorptioni36一、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)屬于粒子誘導(dǎo)離子化(particleinducedionization),采用光子轟擊樣品常用激光:IR(CO2激光器):適用于高分子聚合物、DNA等UV(N2激光器、Nd-YAG):適用于多肽等一、激光解吸離子化(LaserDesorptionion37MALDI-TOFMS
工作原理qV=1/2(m1v12)=1/2(m2v22)若m1
>
m2,則
v1
<
v2t(m/z)分辯率
~400飛行管激光樣品靶15-25kV檢測器無基質(zhì)為LD不能分析大分子(碎裂)MALDI-TOFMS工作原理qV=1/2(m1v1238延遲(脈沖)引出技術(shù)Delay(Pulsed)Extraction++++++20kVVe20kV
10kV0V20kV10kV1517.512.5++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++調(diào)諧延遲時間和引出電壓,達(dá)到最佳分辨率線性分辨率優(yōu)于4000
(insulinBchain)DE+Reflectron,分辨率優(yōu)于20000++++++延遲(脈沖)引出技術(shù)++++++20kVVe0V20kV1039NewSCOUT100MALDIsource(fromREFLEX)MALDISourceNewSCOUT100MALDIsourceMAL40SCOUT100MALDISourcewithMultipoleIonGuideMultipoleionguideTargetplateLaserbeamIonplumeExtractionplateFTMSiontransferopticsToICRcellSCOUT100MALDISourcewithMu41SCOUT100MALDIAccessoryFeatures:Switch-ablesourceto/fromESIX-Ypositioningstage+cameraUpto100samples/plateFastloadlockforeasytargetchangeoverElevatedPressureAdvantagesSCOUT100MALDIAccessoryFeatu42思考題:1.LD適用于哪些質(zhì)量分析器?2.為什么有時加入金屬離子?3.應(yīng)用范圍離子化方法課件43MALDIAccessory-benchmarkdata離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點和難點。用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDIMS分析受到很大制約使用最廣泛,譜庫最完整;transferoptics是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即Conditions:CH3++CH4C2H5++H2X-Ypositioningstage+camera典型的間歇電噴霧的總離子流圖樣品分子在穿過等離子體時,通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移被電離形成MH+或(M-H)-。CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?(LaserDesorptionionization,LD)PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryCI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.Somemoleculesundergoverylittlefragmentation稀釋樣品,使簇合的大分子解離;含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minuteMALDIAccessory-benchmarkdata二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化(Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)常用基質(zhì):2,5-二羥基苯甲酸(DHB)丁二酸(SA)基質(zhì)的作用:1.稀釋樣品,使簇合的大分子解離;2.保護樣品,基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品,避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解;3.通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移等使樣品分子離子化。MALDIAccessory-benchmarkda44離子化方法課件45離子化方法課件46寡聚葡萄糖酸MALDI-TOF,DHB[M+Na]+寡聚葡萄糖酸MALDI-TOF,DHB[M+Na]+47HighMOWSEScoreof159!Masserrorsbelow4mDa!MALDIspectrumofonly1fmoleBSAtrypticdigestusingAnchorChipTM
targets.Withanassumedmax.deviationof5ppm,MASCOTgaveascoreof159forBSA.BSAMALDIanalysisoftrypticdigestsHighMOWSEMasserrorsMALDIs48MALDIAccessory-benchmarkdata34863491349635013506m/zMALDIofInsulinBChainRP=1.1Million!MALDIAccessory-benchmarkda49思考題:1.基質(zhì)的作用2.溶解溶劑的選擇思考題:503以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDIMS分析受到很大制約
--低質(zhì)量區(qū)會有基質(zhì)信號的背景干擾3以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析51基質(zhì):DHB基質(zhì):碳納米管[DHB+Na]+[DHB+2Na-H]+DHBdimer亮氨酸亮氨酸[Leu+2Na-H]+基質(zhì):DHB基質(zhì):碳納米管[DHB+Na]+[DHB+252含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通53可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用,所以脂肪鏈越長,信號越好,比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。頡氨酸可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相54七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS譜七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS譜55碳納米管作為基質(zhì)的一些特性高的比表面積表面原子數(shù)量多,表面活性高,碳納米管可以很好的分散樣品分子,來防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。強的紫外吸收電子只要很小的能量就能被激發(fā),而且可以快速釋放能量弛豫到費米能級,所以碳納米管很容易吸收和傳遞能量使樣品分子從表面解析。碳納米管作為基質(zhì)的一些特性高的比表面積56
三、大氣壓激光解吸離子化(AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI)
三、大氣壓激光解吸離子化(Atmosphericpres57第五節(jié)、大氣壓離子化
(AtmosphericPressureIonization,API)一、電噴霧離子化(Electrospray,ESI)
二、大氣壓化學(xué)電離(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)三、大氣壓光化學(xué)電離第五節(jié)、大氣壓離子化
(Atmos58一、電噴霧離子化(Electrospray,ESI)
離子化過程:1.荷電液滴的產(chǎn)生當(dāng)樣品溶液流出毛細(xì)管的瞬間,在加熱溫度、霧化氣和強電場(3-5Kv)的作用下,溶液迅速霧化并產(chǎn)生高電荷液滴。
2.荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生帶電液滴隨著溶劑蒸發(fā)不斷縮小,液滴表面電荷密度不斷增大,發(fā)生崩散,形成更小的液滴,小的繼續(xù)蒸發(fā),以類似的方式崩散,產(chǎn)生單電荷和多電荷離子。一、電噴霧離子化(Electrospray,ESI)離子化59ESI(electrosprayionization)SolventsprayedacrosspotentialfieldandionizedDropletsevaporatesSolventchargetransferredtoanalytesPolarcompounds
ESIESI(electrosprayionization)60離子化方法課件61牛膝多糖ESI質(zhì)譜圖和(加入適量Cs+)ESI質(zhì)譜圖
牛膝多糖ESI質(zhì)譜圖和(加入適量Cs+)ESI質(zhì)譜圖
62ESIIonSource:ResolutionConditions:Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute49%water,49%methanol,2%aceticacidBroadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scan
Specification:
Resolution>100,000FWHMatm/z779Resolution=198,000+11IsotopeCluster6fmolConsumedESIIonSource:ResolutionCond63細(xì)胞色素b5和突變體細(xì)胞色素b5和突變體64思考題:1.為什么ESI需要溶解性信息?2.離子源類型,和哪些質(zhì)量分析器匹配?3.應(yīng)用范圍4.為什么ESI比較適合和LC、CE聯(lián)用?5.為什么ESI可以測定非共價復(fù)合物?6.形成多電荷離子對質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響?思考題:6501mg/mL,(C)0.Themajorpeakcorrespondstothemolecularion.MALDIofInsulinBChaintransferoptics只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?(一)nanospray三、大氣壓激光解吸離子化(AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI)[DHB+2Na-H]+Fastloadlockforeasytargetchangeover--低質(zhì)量區(qū)會有基質(zhì)信號的背景干擾Specification:CH5++SHSH2++CH4CH4+·和CH3+很快與大量存在的CH4分子起反應(yīng),即:CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?不能分析大分子(碎裂)只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。Somemoleculesundergoverylittlefragmentation二甲苯三個異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對強度甲基紅霉素的質(zhì)譜靈敏度的比較是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即Schematicofthenanoelectrospraysourceapparatus1#-skimmer1,2#-heater,3#-nozzle,4#-shutter,5#-interface,6#-nanoelectrospraytip,7#-steelesstube,8#-screw,9#-highvoltageconnector,10#-X,Zmodulator
余翀?zhí)?、郭寅?化學(xué)學(xué)報2002;60(11):2029
(一)nanospray01mg/mL,(C)0.Schematicofthe66細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜(單張圖譜)從上至下的濃度分別為(A)0.2mg/mL,(B)0.01mg/mL,(C)0.0005mg/mL細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜(單張圖譜)67(二)脈沖噴霧和間歇噴霧1.YuLu,FengZhou,WenqingShui,LipingBian,YinlongGuoandPengyuanYang*AnalChem2001;73(19):4748-47532.劉晗青、郭寅龍*、余翀?zhí)?、楊芃原化學(xué)學(xué)報2002;60(1):171(二)脈沖噴霧和間歇噴霧1.YuLu,FengZhou68典型的間歇電噴霧的總離子流圖
典型的間歇電噴霧的總離子流圖69甲基紅霉素的質(zhì)譜靈敏度的比較(a)間歇電噴霧的方法獲得的質(zhì)譜圖,信噪比的平均值為25.53(b)連續(xù)電噴霧的方法獲得的質(zhì)譜圖,信噪比的平均值為14.72甲基紅霉素的質(zhì)譜靈敏度的比較70(三)雙噴霧FengZhou,WenqingShui,YuLu,PengyuanYang*,andYinlongGuo*RapidCommunicationsinMassSpectrometry2002;16:505-511(三)雙噴霧FengZhou,WenqingShui,71離子化方法課件72二、大氣壓化學(xué)電離(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)當(dāng)樣品溶液流出毛細(xì)管被霧化到加熱管中揮發(fā),在尖端放電電極的高壓作用下先使溶劑分子電離,形成反應(yīng)氣等離子體。樣品分子在穿過等離子體時,通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移被電離形成MH+或(M-H)-。二、大氣壓化學(xué)電離(atmosphericpressure73離子化方法課件74離子化方法課件75離子化方法課件76思考題:1.為什么APCI需要溶解性信息?2.離子源類型,和哪些質(zhì)量分析器匹配?3.應(yīng)用范圍4.為什么APCI比較適合和LC、CE聯(lián)用?5.形成單電荷離子對質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響?思考題:77三、大氣壓光化學(xué)電離三、大氣壓光化學(xué)電離78離子化方法課件79思考題:1.為什么APPI需要溶解性信息?2.離子源類型,和哪些質(zhì)量分析器匹配?3.應(yīng)用范圍4.為什么APPI特別適合和LC、CE聯(lián)用?思考題:80API/MS特點分析極性較大的化合物與GC/MS相互補充與LC、CE、CEC的聯(lián)用“軟”電離技術(shù)
API/MS特點分析極性較大的化合物81第三章、離子化方法思考題:樣品分子為什么首先要離子化才能進(jìn)行質(zhì)譜分析?樣品分子電離是質(zhì)譜測定的必要條件。只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點和難點。第三章、離子化方法思考題:82第一節(jié)、電子轟擊離子化是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即M+eM+。+2e式中M為待測分子,M+。為分子離子或母體離子。第一節(jié)、電子轟擊離子化是通用的電離法,是使用高能83Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectronPrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometrye–Atomormoleculeishitbyhig84Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectron
electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculee–PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryAtomormoleculeishitbyhig85Atomormoleculeishitbyhigh-energyelectron
electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculee–PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryAtomormoleculeishitbyhig86Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryThisenergy-richspecieseject87Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry
formingapositivelycharged,odd-electronspeciescalledthemolecularione–+
?Thisenergy-richspecieseject88formingapositivelycharged,odd-electronspeciescalledthemolecularionFengZhou,WenqingShui,YuLu,PengyuanYang*,andYinlongGuo*Somemoleculesundergoverylittlefragmentation只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。2mg/mL,(B)0.細(xì)胞色素c的納噴霧圖譜(單張圖譜)Broadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scan第四節(jié)、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)MALDIAccessory-benchmarkdataelectronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemoleculeUbiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute若m1>m2,則v1<v2間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖為什么APCI比較適合和LC、CE聯(lián)用?Delay(Pulsed)Extraction一、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)YuLu,FengZhou,WenqingShui,LipingBian,YinlongGuoandPengyuanYang*X-Ypositioningstage+cameraIR(CO2激光器):適用于高分子聚合物、DNA等TargetplateThemoleculariondissociatestoacation
andaradical.PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry+
?formingapositivelycharged,89 20 40 60 80 100 120m/zm/z=78100806040200Relative
intensitySomemoleculesundergoverylittlefragmentation
Benzeneisanexample.Themajorpeakcorrespondstothemolecularion. 20 40 60 80 100 120m/zm/z=90離子化方法課件91思考題:1.EI的應(yīng)用范圍2.EI的特點使用最廣泛,譜庫最完整;電離效率高;結(jié)構(gòu)簡單,操作方便;分子離子峰強度較弱或不出現(xiàn)(因電離能量最高)。3.EI中通常的能量為多少?轟擊電子能量改變對質(zhì)譜的影響有哪些?4.為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會出現(xiàn)MH+,而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。5.EI適用于何種質(zhì)量分析器?思考題:92離子化方法課件93離子化方法課件94離子化方法課件95第二節(jié)、化學(xué)電離離子化
一、化學(xué)電離離子
二、自身化學(xué)電離離子化第二節(jié)、化學(xué)電離離子化
一、化學(xué)電離離子
96一、化學(xué)電離離子化(ChemicalIonization,CI)
化學(xué)電離源一般在1.3102~1.3103Pa。通過離子
-分子反應(yīng)來進(jìn)行。試劑氣通常為甲烷CH4。首先用高能電子,使CH4電離產(chǎn)生CH5+和C2H5+,即:CH4+eCH4+·+2eCH4+·CH3++H·CH4+·和CH3+很快與大量存在的CH4分子起反應(yīng),即:CH4+·+CH4CH5++CH3·
CH3++CH4C2H5++H2小量樣品(試樣與甲烷之比為11000)導(dǎo)入離子源,試樣分子(SH)發(fā)生下列反應(yīng):CH5++SHSH2++CH4
C2H5++SHS++C2H6SH2+和S+然后可能碎裂,產(chǎn)生質(zhì)譜。一、化學(xué)電離離子化(ChemicalIonization,97PCI甲烷反應(yīng)機理CH4e-HCH3CH4CH4+?CH3+MMM-H+CH5+CH3?CH4M+H+230eVPCI甲烷反應(yīng)機理CH4e-HCH3CH4CH4+?CH398離子化方法課件99三、大氣壓激光解吸離子化CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometrytransferoptics含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minute[DHB+2Na-H]+形成單電荷離子對質(zhì)譜分析產(chǎn)生什么影響?表面原子數(shù)量多,表面活性高,碳納米管可以很好的分散樣品分子,來防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。electronisdeflectedbuttransfersmuchofitsenergytothemolecule二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化(Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即Solventchargetransferredtoanalytes使用最廣泛,譜庫最完整;MALDI-TOF,DHBEI適用于何種質(zhì)量分析器?三、大氣壓激光解吸離子化(AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI)可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用,所以脂肪鏈越長,信號越好,比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。2,5-二羥基苯甲酸(DHB)MultipoleionguidePCI三、大氣壓激光解吸離子化PCI100NCISpectraNCISpectra101思考題:1.什么情況下需要采用CI?2.CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?3.CI的用途4.比較CI和EI的靈敏度5.CI實現(xiàn)準(zhǔn)確質(zhì)量測定是否容易?6.CI的局限性思考題:102二、自身化學(xué)電離離子化(Self-chemicalionization,SCI)FTMS和離子阱的內(nèi)離子源中出現(xiàn)的特殊方法。樣品分子本身在電子轟擊時產(chǎn)生CH5+、C2H5+、C3H7+等可提供質(zhì)子的碎片離子,通過增加離子在阱中的運動時間,提高它們和分子的碰撞幾率,提高M(jìn)H+的強度,以實現(xiàn)CI。二、自身化學(xué)電離離子化(Self-chemicalioni103紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖紅霉素EI和SCI質(zhì)譜圖104離子化方法課件105離子化方法課件106乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫檢索結(jié)果
乙醚SCI反應(yīng)所得到質(zhì)譜的NIST98庫檢索結(jié)果107烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖
烯丙醇FTMS分子離子反應(yīng)質(zhì)譜圖108離子化方法課件109第二節(jié)、化學(xué)電離離子化離子源內(nèi)真空度高對分析什么樣品有利?2,5-二羥基苯甲酸(DHB)MALDI-TOFMS工作原理保護樣品,基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品,避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解;IR(CO2激光器):適用于高分子聚合物、DNA等CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?離子源內(nèi)真空度高對分析什么樣品有利?CH3++CH4C2H5++H2屬于粒子誘導(dǎo)離子化(particleinducedionization),采用高能中型粒子(Ar)轟擊樣品典型的間歇電噴霧的總離子流圖添加金屬離子(如:NaCl、KCl、AgNO3)的目的?含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即[M+CH3CO]+/[CH3CO+]典型的間歇電噴霧的總離子流圖PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometry離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點和難點。1Million!Somemoleculesundergoverylittlefragmentation--低質(zhì)量區(qū)會有基質(zhì)信號的背景干擾典型的間歇電噴霧的總離子流圖第二節(jié)、化學(xué)電離離子化(b)連續(xù)電噴霧的方法獲得的質(zhì)譜圖,信噪比的平均值為14.MALDI-TOF,DHB[Leu+2Na-H]+間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖保護樣品,基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品,避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解;二甲苯三個異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對強度只有帶電的離子才能在質(zhì)量分析器中被分離。Broadbanddetectionfromm/z400to2500,acquire1scanIR(CO2激光器):適用于高分子聚合物、DNA等Conditions:離子源內(nèi)真空度高對分析什么樣品有利?為什么四極質(zhì)譜、FTMS、離子阱質(zhì)譜會出現(xiàn)MH+,而磁質(zhì)譜很難出現(xiàn)MH+。SCOUT100MALDIAccessory荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生Specification:PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryMALDIAccessory-benchmarkdata--低質(zhì)量區(qū)會有基質(zhì)信號的背景干擾(一)nanospray思考題:1.FTMS中SCI的特點?和CI相比有哪些優(yōu)勢?2.離子源內(nèi)真空度高對分析什么樣品有利?3.MH+的強度和哪些因素有關(guān)?4.應(yīng)用范圍第二節(jié)、化學(xué)電離離子化典型的間歇電噴霧的總離子流圖思考題:110間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜圖
間二甲苯、對二甲苯和鄰二甲苯以丙酮為反應(yīng)氣得到化學(xué)電離的質(zhì)譜111
二甲苯三個異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相對強度
[M+H]+/CH3COH+CH3[M+CH3CO]+/[CH3CO+]間二甲苯11.361.54對二甲苯1.930.425鄰二甲苯0.348二甲苯三個異構(gòu)體[M+H]+和[M+CH3CO]+的相112第三節(jié)、快原子轟擊離子化(Fastatombombardment,FAB)屬于粒子誘導(dǎo)離子化(particleinducedionization),采用高能中型粒子(Ar)轟擊樣品常用底物:G甘油NBA間硝基芐醇
第三節(jié)、快原子轟擊離子化(Fastatombombard113離子化方法課件114離子化方法課件115思考題:1.FAB和CI相比有何特點?2.添加金屬離子(如:NaCl、KCl、AgNO3)的目的?3.與活潑氫可以可以發(fā)生反應(yīng)的樣品是否可以進(jìn)行FAB測定?4.為什么在送FAB測試樣品時需要溶解性的信息?5.FAB適用于什么類型樣品?思考題:116第四節(jié)、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)一、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化(Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)三、大氣壓激光解吸離子化(AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI)第四節(jié)、激光解吸離子化(LaserDesorptioni117一、激光解吸離子化(LaserDesorptionionization,LD)屬于粒子誘導(dǎo)離子化(particleinducedionization),采用光子轟擊樣品常用激光:IR(CO2激光器):適用于高分子聚合物、DNA等UV(N2激光器、Nd-YAG):適用于多肽等一、激光解吸離子化(LaserDesorptionion118MALDI-TOFMS
工作原理qV=1/2(m1v12)=1/2(m2v22)若m1
>
m2,則
v1
<
v2t(m/z)分辯率
~400飛行管激光樣品靶15-25kV檢測器無基質(zhì)為LD不能分析大分子(碎裂)MALDI-TOFMS工作原理qV=1/2(m1v12119延遲(脈沖)引出技術(shù)Delay(Pulsed)Extraction++++++20kVVe20kV
10kV0V20kV10kV1517.512.5++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++調(diào)諧延遲時間和引出電壓,達(dá)到最佳分辨率線性分辨率優(yōu)于4000
(insulinBchain)DE+Reflectron,分辨率優(yōu)于20000++++++延遲(脈沖)引出技術(shù)++++++20kVVe0V20kV10120NewSCOUT100MALDIsource(fromREFLEX)MALDISourceNewSCOUT100MALDIsourceMAL121SCOUT100MALDISourcewithMultipoleIonGuideMultipoleionguideTargetplateLaserbeamIonplumeExtractionplateFTMSiontransferopticsToICRcellSCOUT100MALDISourcewithMu122SCOUT100MALDIAccessoryFeatures:Switch-ablesourceto/fromESIX-Ypositioningstage+cameraUpto100samples/plateFastloadlockforeasytargetchangeoverElevatedPressureAdvantagesSCOUT100MALDIAccessoryFeatu123思考題:1.LD適用于哪些質(zhì)量分析器?2.為什么有時加入金屬離子?3.應(yīng)用范圍離子化方法課件124MALDIAccessory-benchmarkdata離子化方法的研究一直是質(zhì)譜分析的熱點和難點。用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDIMS分析受到很大制約使用最廣泛,譜庫最完整;transferoptics是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即Conditions:CH3++CH4C2H5++H2X-Ypositioningstage+camera典型的間歇電噴霧的總離子流圖樣品分子在穿過等離子體時,通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移被電離形成MH+或(M-H)-。CI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?(LaserDesorptionionization,LD)PrinciplesofElectron-ImpactMassSpectrometryCI離子源的壓力為1torr,EI為10-5-10-6torr,為什么?Thisenergy-richspeciesejectsanelectron.Somemoleculesundergoverylittlefragmentation稀釋樣品,使簇合的大分子解離;含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。是通用的電離法,是使用高能電子束從試樣分子中撞出一個電子而產(chǎn)生正離子,即Ubiquitin,1pmol/uLinjectedat1uL/minuteMALDIAccessory-benchmarkdata二、基質(zhì)輔助激光解吸離子化(Matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)常用基質(zhì):2,5-二羥基苯甲酸(DHB)丁二酸(SA)基質(zhì)的作用:1.稀釋樣品,使簇合的大分子解離;2.保護樣品,基質(zhì)吸收激光能量后轉(zhuǎn)移給樣品,避免激光直接照射樣品分子而引起樣品分解;3.通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移等使樣品分子離子化。MALDIAccessory-benchmarkda125離子化方法課件126離子化方法課件127寡聚葡萄糖酸MALDI-TOF,DHB[M+Na]+寡聚葡萄糖酸MALDI-TOF,DHB[M+Na]+128HighMOWSEScoreof159!Masserrorsbelow4mDa!MALDIspectrumofonly1fmoleBSAtrypticdigestusingAnchorChipTM
targets.Withanassumedmax.deviationof5ppm,MASCOTgaveascoreof159forBSA.BSAMALDIanalysisoftrypticdigestsHighMOWSEMasserrorsMALDIs129MALDIAccessory-benchmarkdata34863491349635013506m/zMALDIofInsulinBChainRP=1.1Million!MALDIAccessory-benchmarkda130思考題:1.基質(zhì)的作用2.溶解溶劑的選擇思考題:1313以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析用經(jīng)典的基質(zhì)進(jìn)行氨基酸的MALDIMS分析受到很大制約
--低質(zhì)量區(qū)會有基質(zhì)信號的背景干擾3以碳納米管為基質(zhì)的MALDI-MS分析132基質(zhì):DHB基質(zhì):碳納米管[DHB+Na]+[DHB+2Na-H]+DHBdimer亮氨酸亮氨酸[Leu+2Na-H]+基質(zhì):DHB基質(zhì):碳納米管[DHB+Na]+[DHB+2133含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通過碳納米管傳遞,也可以直接吸收能量進(jìn)行解析,比如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸含芳香環(huán)或雜環(huán)的氨基酸有紫外吸收,所以能量不僅可以通134可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相互作用,所以脂肪鏈越長,信號越好,比如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。頡氨酸可能由于納米管中的碳原子能和氨基酸的脂肪鏈有某種相135七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS譜七種氨基酸混合溶液的MALDI-FTMS譜136碳納米管作為基質(zhì)的一些特性高的比表面積表面原子數(shù)量多,表面活性高,碳納米管可以很好的分散樣品分子,來防止它們之間的簇合或減弱分子間的相互作用。強的紫外吸收電子只要很小的能量就能被激發(fā),而且可以快速釋放能量弛豫到費米能級,所以碳納米管很容易吸收和傳遞能量使樣品分子從表面解析。碳納米管作為基質(zhì)的一些特性高的比表面積137
三、大氣壓激光解吸離子化(AtmosphericpressureMALDI,AP-MALDI)
三、大氣壓激光解吸離子化(Atmosphericpres138第五節(jié)、大氣壓離子化
(AtmosphericPressureIonization,API)一、電噴霧離子化(Electrospray,ESI)
二、大氣壓化學(xué)電離(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)三、大氣壓光化學(xué)電離第五節(jié)、大氣壓離子化
(Atmos139一、電噴霧離子化(Electrospray,ESI)
離子化過程:1.荷電液滴的產(chǎn)生當(dāng)樣品溶液流出毛細(xì)管的瞬間,在加熱溫度、霧化氣和強電場(3-5Kv)的作用下,溶液迅速霧化并產(chǎn)生高電荷液滴。
2.荷電液滴中氣相離子的產(chǎn)生帶電液滴隨著溶劑蒸發(fā)不斷縮小,液滴表面電荷密度不斷增大,發(fā)生崩散,形成更小的液滴,小的繼續(xù)蒸發(fā),以類似的方式崩散,產(chǎn)生單電荷和多電荷離子。一、電噴霧離子化(Electrospray,ESI)離子化140ESI(electrosprayionization)SolventsprayedacrosspotentialfieldandionizedDropletsevapora
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