動(dòng)物早期胚胎操作

關(guān)于動(dòng)物早期胚胎操作第一頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)、胚胎移植技術(shù)一、胚胎移植的概念及生理基礎(chǔ)和原則：概念：借助一定的器械，從一頭優(yōu)良雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)取出早期胚胎，移植到另一頭處于相同生理階段的雌性動(dòng)物的相應(yīng)部位，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個(gè)體。即借腹懷胎。供體：提供胚胎的個(gè)體，一般為良種。受體：接受胚胎的個(gè)體，提供胚胎孕育時(shí)間和空間。第二頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日胚胎移植的意義1.充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力，加快優(yōu)良品種的改良。對(duì)牛羊等繁殖力較低的優(yōu)良品種來(lái)說(shuō)，結(jié)合人工受精技術(shù)可克服其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制。2.體外受精、胚胎嵌合和核移植等技術(shù)都必須通過(guò)胚胎移植獲得活體。3.結(jié)合胚胎冷凍可長(zhǎng)期保存珍貴遺傳資源，并且方便它們的運(yùn)輸。第三頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日一）胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬(wàn)個(gè)卵泡，在外源激素作用下，每個(gè)發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達(dá)十?dāng)?shù)個(gè)每個(gè)發(fā)情周期生殖器官都有一個(gè)孕向發(fā)育早期胚胎處于游離狀態(tài)胚胎發(fā)育不存在免疫問(wèn)題胚胎發(fā)育到一定階段會(huì)與子宮發(fā)生生理和組聯(lián)系胚胎的遺傳性不受受體的影響第四頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日二）胚胎移植的基本原則胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性。動(dòng)物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時(shí)間上的同期性。動(dòng)物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性胚胎發(fā)育的期限：胚胎日齡不能超過(guò)周期黃體的壽命。胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過(guò)程中不受不良因素的影響。至目錄第五頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日二、胚胎移植的技術(shù)程序1.供體和受體的選擇2.供體的超數(shù)排卵處理3.同期發(fā)情處理4.供體早期胚胎的收集5.胚胎的檢查6.胚胎的保存與培養(yǎng)7.胚胎的移植8.供體和受體的術(shù)后觀察第六頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日一）供體和受體的選擇供體應(yīng)具有相當(dāng)高的育種價(jià)值供體生殖機(jī)能應(yīng)處于較高的狀態(tài)：無(wú)生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)強(qiáng)健受體應(yīng)容易購(gòu)買，繁殖性能好，對(duì)地方適應(yīng)性強(qiáng)，體型中上等，非優(yōu)良品種受體健康狀況良好，已進(jìn)入發(fā)情季節(jié)供受體發(fā)情時(shí)間應(yīng)接近或一致第七頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日二）供體的超數(shù)排卵處理超數(shù)排卵：雌性動(dòng)物間情期內(nèi)，注射外源促性腺激素，誘發(fā)其卵巢上大量卵泡發(fā)育并排卵的方法稱為超數(shù)排卵超排原理：

外源激素可以改變卵巢上只有一個(gè)或少數(shù)卵泡成熟排卵的定勢(shì)，解除單胎動(dòng)物優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育對(duì)同一撥其他卵泡發(fā)育的抑制作用，促使同一撥卵泡群中大部分卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵。

動(dòng)物常用超排激素：PMSG、FSH、LH、PGF2α、GnRH、hCG等第八頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日超數(shù)排卵的意義采用超數(shù)排卵可大大增加每次的排卵數(shù)量在科研上可以在短時(shí)間內(nèi)取得大量的卵和胚胎，可以滿足胚胎工程研究、遺傳工程研究和建立胚胎庫(kù)的需要。大大縮短了研究周期在生產(chǎn)中，可以提高優(yōu)秀動(dòng)物的繁殖數(shù)量，提高產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益。第九頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日1.小鼠的超數(shù)排卵腹腔注射PMSG10U，一般選擇在中午注射，間隔48小時(shí)后注射HCG，光照周期保持12～14h，超數(shù)排卵方法第十頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日2.牛的超數(shù)排卵

1）促卵泡素(FSH)減量注射法：供體牛在發(fā)情后的9～13d肌注FSH，早晚各一次，間隔12h，分4d減量注射。在第3d時(shí)同時(shí)宮注PGF2α2.0～2.4mg或氯前列烯醇0.6mg。如使用國(guó)產(chǎn)FSH總劑量為325單位時(shí)，處理方法如附圖所示。超排劑量根據(jù)不同廠家激素確定適宜劑量，國(guó)產(chǎn)激素320～360單位，進(jìn)口激素28～36mg。第十一頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日牛超數(shù)排卵示意圖第十二頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日2）.PMSG法孕馬血清促性腺激素(PMSG)處理法在情期的11～12d，一次肌注PMSG2500～30001U，48h后宮注PGF2α2.4mg。發(fā)情后約18h肌注等量的抗PMSG。第十三頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日發(fā)情觀察和配種

PGF2α處理后40～48h，大部分處理牛發(fā)情。通常要求從注PGF第2d傍晚開(kāi)始觀察發(fā)情，至少早晚各觀察一次。在觀察到接受爬跨后4～6h進(jìn)行第一次輸精，間隔12h后第二次輸精。每次有效精子數(shù)不得少于50×106，輸入兩側(cè)子宮角或子宮體。注意輸精時(shí)不得觸摸卵巢。第十四頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日3.羊的超數(shù)排卵可采用牛的超排處理方法，F(xiàn)SH減量注射或PMSG+PGF2α法。也可采用如下方法：每日肌注孕酮10-12mg，連續(xù)處理約14d后，一次性肌注PMSG1000—2000IU，1—2天配種。第十五頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日影響超數(shù)排卵的因素：1.動(dòng)物個(gè)體狀況：不同個(gè)體對(duì)激素的敏感性不同動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)的差異動(dòng)物的年齡差異2.外界環(huán)境因素：季節(jié)光照周期氣候條件及動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)水平3.藥物因素：PMSG、FSH等4.激素的注射部位及超排程序第十六頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日三）同期發(fā)情（一）同期發(fā)情（同步發(fā)情）：用人工的方法對(duì)母畜發(fā)情周期進(jìn)行同期化處理的方法叫同期發(fā)情。在胚胎移植技術(shù)中，受體子宮和供體胚胎處于高度同步化狀態(tài)才有利于移植胚的發(fā)育。1.同期發(fā)情在畜牧生產(chǎn)中的意義：A.便于集中或定時(shí)對(duì)一群母畜進(jìn)行輸精；B.可做到同期配種，從而使母畜的妊娠、分娩、幼畜的培育相對(duì)集中，提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。C.利于家畜的胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用。第十七頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日2.同期發(fā)情的機(jī)理：主要是借助外源激素對(duì)卵巢的作用，使被處理的母畜卵巢按預(yù)定的要求發(fā)生變化，并使其功能處于一個(gè)共同的基礎(chǔ)之上，達(dá)到同期表現(xiàn)發(fā)情的目的。目前的同期發(fā)情技術(shù)有兩種方法：A.用孕激素處理抑制卵巢上卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn)，待所有處理母畜的自然黃體退化，功能消失后，同時(shí)停藥；此時(shí)，由于卵巢失去了孕激素的抑制作用，于是卵泡又迅速發(fā)育并表現(xiàn)發(fā)情。B.采用具有溶黃體作用的前列腺素及其類似物，使卵巢上的功能黃體同時(shí)迅速溶解、消退，使卵泡解除抑制并迅速發(fā)育，從而導(dǎo)致母畜的同期發(fā)情。第十八頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日3.用于同期發(fā)情的激素和使用方法：用于同期發(fā)情的激素及其類似物可分兩類：一是抑制卵巢上的卵泡發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn)的孕激素類物質(zhì)；二是促使黃體溶解和消退的前列腺素制劑；另外，還有一些是在以上兩類激素施用基礎(chǔ)上，為獲得更好的發(fā)情和受胎效果，用來(lái)促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)、成熟和排卵的一些輔助激素，主要有：促卵泡素、促黃體素、孕馬血清促性腺激素、人絨毛膜促性腺激素和促性腺激素釋放激素（GnRH)等。第十九頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日四）供體早期胚胎的收集胚胎的收集是指在配種或輸精后的適當(dāng)時(shí)間，從超排供體回收胚胎，以準(zhǔn)備給受體移植，簡(jiǎn)稱采胚。一般將配種當(dāng)日記為0天，從配種后第二天開(kāi)始計(jì)算采胚天數(shù)。不同動(dòng)物早期胚胎發(fā)育速度和到達(dá)子宮的時(shí)間各有差異（p314，表12-3），應(yīng)根據(jù)采胚目的來(lái)選擇合適的采胚時(shí)間。第二十頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日采胚方法：大家畜：手術(shù)法非手術(shù)法小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：處死動(dòng)物，解剖法。第二十一頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日手術(shù)法：早期胚胎（如4d以前）的收集：剖腹，拉出輸卵管和子宮，從子宮角尖端（牛、羊）或輸卵管末端（豬）注入沖胚液，從輸卵管傘部接取沖胚液。晚期胚胎（胚胎已經(jīng)進(jìn)入子宮角）的收集：從子宮角上端注入30—50ml的沖胚液，由基部接取，或由基部入針，從上端接取。第二十二頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日大動(dòng)物手術(shù)法采胚第二十三頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第二十四頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第二十五頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日非手術(shù)法：此法一般適宜配種后6-8天胚胎的收集。母畜保定---尾椎硬膜外腔麻醉---插入三通管---由充氣孔注水或氣體至氣球膨脹，使子宮角基部堵塞---30-60ml沖胚液從注射孔灌入，充滿整個(gè)子宮角---輔以按摩子宮，或?qū)⒆訉m角倒提等方法令沖胚液回流，從回收孔收集。第二十六頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第二十七頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的采胚：（1）輸卵管采胚法：以脫頸椎法殺死受精1天后的母鼠（此時(shí)胚胎一般處于2細(xì)胞期），暴露子宮、輸卵管；剪下子宮、輸卵管，置于平皿中；在滅菌平皿中剪下輸卵管置入盛有沖卵液的集卵杯中，在體視顯微鏡下撕開(kāi)壺腹部，釋放受精卵并用用新鮮的培養(yǎng)液洗1–2次。第二十八頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第二十九頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日用透明質(zhì)酸酶處理受精卵細(xì)胞團(tuán)第三十頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第三十一頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日

（2）子宮采胚法：受精后60–72小時(shí)，一些致密的8細(xì)胞胚胎已進(jìn)入子宮。而桑椹胚和囊胚的收集則一定要從子宮中獲得。

需熟悉小鼠胚胎著床前發(fā)育過(guò)程（p316圖12-6）第三十二頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日五）供體胚胎的分級(jí)檢查沖胚液回收后，應(yīng)立即收集沖胚液中的胚胎，并進(jìn)行質(zhì)量檢查。形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：教材P318、P319形態(tài)大小正常，卵裂球均一，透明帶完整等。采卵時(shí)間與胚胎發(fā)育時(shí)間是否吻合。第三十三頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日六）胚胎移植手術(shù)法胚胎移植：第三十四頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第三十五頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日大動(dòng)物非手術(shù)法胚胎移植目前牛的胚胎移植主要采用非手術(shù)法。人工受精管中裝入胚胎，通過(guò)子宮頸后注入所裝胚胎即可。注意：移植前應(yīng)保證受體牛生殖道無(wú)病理情況移植中要盡量減少對(duì)生殖道的刺激，以免引起子宮收縮排出移植胚。第三十六頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日在體視顯微鏡下觀察輸卵管傘，并用移卵管吸取胚胎，次序?yàn)槭炗汀⒖諝馀?、培養(yǎng)液、空氣泡2、胚胎(盡可能少帶入培養(yǎng)液)。空氣泡3、培養(yǎng)液。第三十七頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第三十八頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日七）影響胚胎移植成功率的因素1.胚胎因素：胚胎的質(zhì)量、發(fā)育階段、數(shù)量、供體質(zhì)量、體外停留時(shí)間等。2.母體因素：供受體發(fā)情的同期化程度、受體孕酮水平、移植部位、受體營(yíng)養(yǎng)水平、受體子宮等生殖系統(tǒng)狀態(tài)等。3.其他因素：移植方法、污染程度、操作熟練程度等。第三十九頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)、胚胎分割技術(shù)胚胎分割(embryosplitting)是運(yùn)用顯微操作系統(tǒng)將哺乳動(dòng)物附植前胚胎分成若干個(gè)具有繼續(xù)發(fā)育潛力部分的生物技術(shù)，運(yùn)用胚胎分割可獲得同卵孿生后代。在畜牧生產(chǎn)上，胚胎分割可用來(lái)擴(kuò)大優(yōu)良家畜的數(shù)量;在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)或醫(yī)學(xué)中，運(yùn)用同卵孿生后代作實(shí)驗(yàn)材料，可消除遺傳差異，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

第四十頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日一、胚胎切割的基本程序

1.切割器具的準(zhǔn)備

器械：倒置顯微鏡和顯微操作儀。

胚胎固定管：末端鈍圓，外徑與所固定胚胎直徑相近，內(nèi)徑一般為20~30um。

切割針：玻璃針和微刀兩種。玻璃針一般用實(shí)心玻璃棒拉成，微刀是用鋒利的金屬刀片與微細(xì)玻璃棒粘在一起制成

第四十一頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日玻璃針進(jìn)行胚胎分割微刀進(jìn)行胚胎分割第四十二頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日2.胚胎預(yù)處理：為了減少切割損傷，胚胎在切割前一般用鏈霉蛋白酶進(jìn)行短時(shí)間處理，使透明帶軟化并變薄或者在顯微操作儀下直接去除透明帶。3.胚胎分割方法：1）willadsen法2）williams法3）鈴木分割法4）顯微吸管分割法5）徒手分割法第四十三頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日(1)桑椹胚之前的胚胎（Willianms分割法）這一階段胚胎因?yàn)槁蚜亚蜉^大，直接切割對(duì)卵裂球的損傷較大。常用的方法是用微針切開(kāi)透明帶，用微管吸取單個(gè)或部分卵裂球，放人另一空透明帶中，空透明帶通常來(lái)自未受精卵或退化的胚胎。

第四十四頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日(2)桑椹胚和囊胚的分割

對(duì)于這一階段的胚胎，通常采用直接切割法，操作時(shí)，用微針或微刀由胚胎正上方緩慢下降，輕壓透明帶以固定胚胎，然后繼續(xù)下切，直至胚胎一分為二，再把裸露半胚移入預(yù)先準(zhǔn)備好的空透明帶中，或直接移植給受體。在進(jìn)行囊胚切割時(shí)，要注意將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)等分（P325圖12－18）。

第四十五頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日4.分割胚的培養(yǎng)

為提高半胚移植的妊娠率和胚胎利用率，分割后的半胚需放入空透明帶中或者用瓊脂包埋移入中間受體在體內(nèi)或直接在體外培養(yǎng)。半胚的體外培養(yǎng)方法基本同于體外受精卵。體內(nèi)培養(yǎng)的中間受體一般選擇綿羊、家兔等動(dòng)物的輸卵管，輸卵管在胚胎移入后需要結(jié)扎以防胚胎丟失。

瓊脂包埋的作用是固定胚胎，便于回收，但不影響胚胎的發(fā)育。發(fā)育良好的胚胎可移植到受體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育或進(jìn)行再分割.第四十六頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日二、影響胚胎分割效果的因素一）分割胚的發(fā)育1.透明帶的作用：保護(hù)作用2.胚胎分割程度：分割程度越高，分割胚囊胚發(fā)育成功率越低。3.胚胎不同發(fā)育階段：牛分割胚實(shí)驗(yàn)表明，來(lái)自囊胚的半分割胚發(fā)育成功率要高于桑葚胚的半分割胚。第四十七頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日二）影響胚胎分割效果的因素1.分割胚胎發(fā)育的階段2.胚胎分割的次數(shù)3.操作液4.動(dòng)物種類5.分割胚的移植第四十八頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日2008年9月9日下午5時(shí)，小公犢“明明”在廣西水牛研究所順利誕生，它是世界首例胚胎分割-性別鑒定試管水牛，這意味著水牛性別控制又找到了一條具有實(shí)用價(jià)值的新途徑。圖為9月10日下午，一身黝黑的“明明”（右）與另一頭小牛犢在玩耍。第四十九頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日(三)胚胎分割存在的問(wèn)題1.初生體重低

在牛切割胚胎移植實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)有些分割胚即使培養(yǎng)到囊胚階段，與正常胚胎相比，細(xì)胞數(shù)明顯減少，移植后代的體重也相應(yīng)降低。這可能與早期胚胎細(xì)胞的分化和定位有關(guān)，但發(fā)育機(jī)理還有待深入研究。

第五十頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日2.遺傳一致性同一胚胎切割后獲得的后代，在理論上，遺傳性狀應(yīng)該完全一致，但事實(shí)并不這樣。人們發(fā)現(xiàn)6-7日齡牛胚胎分割后，同卵雙生犢牛的毛色和斑紋并不完全相同，而在2-細(xì)胞階段分割，卻表現(xiàn)出遺傳一致性。這種現(xiàn)象與胚胎細(xì)胞的分化有密切關(guān)系，但目前對(duì)不同階段胚胎細(xì)胞的分化時(shí)間和發(fā)育潛力了解很少。第五十一頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日3.同卵多胎的局限性從目前的研究來(lái)看，由一枚胚胎通過(guò)胚胎分割方式獲得的后代數(shù)量有限.迄今，最好的結(jié)果是由一枚牛胚胎獲得3個(gè)牛犢，這說(shuō)明孿生胚胎的發(fā)育潛力很有限。因此，通過(guò)胚胎分割技術(shù)生產(chǎn)大量克隆動(dòng)物在目前還難以取得進(jìn)展。第五十二頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日概念

嵌合體：同一個(gè)體中同時(shí)存在不同基因型的細(xì)胞或組織，這種個(gè)體成為嵌合體。胚胎嵌合：把兩個(gè)或多個(gè)不同基因型的早期胚胎（細(xì)胞）聚集在一起形成復(fù)合胚胎，進(jìn)而發(fā)育為不同程度嵌合個(gè)體的過(guò)程。第三節(jié)、嵌合體技術(shù)第五十三頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日研究意義：

1.發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域：如不同基因嵌合體將來(lái)在組織中的分布、卵裂球的分化傾向等

2.醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：建立人類疾病模型等

3.動(dòng)物生產(chǎn)上：培育雜種個(gè)體，甚至中間個(gè)體。如制作新型皮毛花色的嵌合動(dòng)物；與ES嵌合還能生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。第五十四頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日嵌合體胚胎制作方法：1.主要設(shè)備：顯微操作儀、拉針儀、煅針儀、磨針儀等2.顯微工具（毛細(xì)玻璃針）的制備：固定針：內(nèi)徑20－30um

注射針：拉針－煅燒－磨針－洗滌第五十五頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日胚胎嵌合操作方法（1）聚合法卵裂球聚合法：P328圖a（2）注入法細(xì)胞（卵裂球、ICM、ES等）顯微注入囊胚腔中，與ICM合并，最后發(fā)育得到的個(gè)體即嵌合胚。P328圖b第五十六頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日嵌合體的分析與鑒定1色素分析法：簡(jiǎn)單、直觀。如白鼠、黑鼠的嵌合情況分析。2同工酶分析法：GPI(磷酸葡萄糖異構(gòu)酶分析)。待鑒定嵌合動(dòng)物組織勻漿后，在醋酸纖維素板上點(diǎn)樣、電泳、染色后與標(biāo)準(zhǔn)同工酶譜對(duì)比。3其他方法：染色體組型、數(shù)目等第五十七頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日嵌合率的影響因素供體細(xì)胞（供體細(xì)胞發(fā)育的全能性、核型的正常與否及遺傳背景對(duì)種系嵌合率有較大影響。）受體胚胎一般來(lái)說(shuō)，導(dǎo)入的受體胚胎越早，其形成嵌合體的嵌合程度越高，但嵌合體的獲得率低。致密化胚胎和胚胎干細(xì)胞粘附能力強(qiáng)，有利于形成生殖系嵌合。而未致密化胚胎卵裂球之間未形成緊密連接，在聚合法操作過(guò)程中易散失。第五十八頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日第四節(jié)、細(xì)胞核移植技術(shù)一、核移植定義：通過(guò)顯微操作的方法，將供體細(xì)胞的細(xì)胞核放入預(yù)先去核的卵母細(xì)胞或早期受精卵中，形成一個(gè)新的核質(zhì)重組胚，供體核在受體胞質(zhì)作用下，發(fā)生發(fā)育程序重編，使得重組胚得以分裂、分化并最終發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體。狹義的動(dòng)物克隆僅指細(xì)胞核移植，廣義的動(dòng)物克隆還包括卵裂球分離、胚胎分割。第五十九頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日二、核移植技術(shù)方法供體細(xì)胞的準(zhǔn)備受體胞質(zhì)的準(zhǔn)備卵母細(xì)胞的去核重組胚的構(gòu)建重組胚的激活重組胚的培養(yǎng)和胚胎移植第六十頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日1.供體細(xì)胞的準(zhǔn)備供體細(xì)胞的要求：1）正常二倍體細(xì)胞，有完整基因組；2）供體核與受體胞質(zhì)能很好融合并順利啟動(dòng)分裂和進(jìn)行發(fā)育程序的重編。供體細(xì)胞的類型：1）胚胎細(xì)胞：早期胚胎細(xì)胞、ICM2）胚胎干細(xì)胞3）體細(xì)胞供體細(xì)胞的分離方法：略第六十一頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日常用的體細(xì)胞：乳腺上皮細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等。為了便于核移植后的核質(zhì)融合，供體細(xì)胞核移植前往往要進(jìn)行血清饑餓培養(yǎng)，使之停留于G0期。第六十二頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日2.胞質(zhì)受體細(xì)胞的類型：M2期卵母細(xì)胞、合子期受精卵、2細(xì)胞胚胎其中，M2期卵母細(xì)胞是最常用的受體細(xì)胞類型，一方面，其重組胚的發(fā)育率較高（MPF活性較高），另一方面，M2期的卵母細(xì)胞也便于去核操作。M2期卵母細(xì)胞的來(lái)源途徑：體內(nèi)成熟、體外成熟第六十三頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日3.卵母細(xì)胞的去核1）盲吸法：去核率、重組胚發(fā)育率高。2）半卵去核法：胞質(zhì)損失太多，極少應(yīng)用。3）化學(xué)誘導(dǎo)去核法：藥物處理，核全入PB2.第六十四頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日A:

盲吸法去核前MⅡ期卵母細(xì)胞B:

去核后卵母細(xì)胞圖1

MⅡ卵母細(xì)胞去核(×200)

第六十五頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日MⅡ卵母細(xì)胞去核前后H33342熒光染色(×100)

第六十六頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日4.重組胚的構(gòu)建1）融合法：滅活仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)融合法：安全性差，極少使用。電融合法：常用融合液為0.05MCacl2、0.1MMgSO4的0.3M甘露糖溶液。不同細(xì)胞融合參數(shù)需要摸索。第六十七頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日2）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注核法用極細(xì)注射針（外徑約10um）直接將供體核快速注入受體卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。此法是體細(xì)胞核移植的常用融合方法。第六十八頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日5.重組胚的激活受精生物學(xué)的研究表明：重組胚的激活關(guān)鍵在于卵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鈣離子的振蕩。激活方法：1）電擊法：模仿正常受精過(guò)程，多次電脈沖對(duì)卵母細(xì)胞激活，是目前采用最多的方法。2）乙醇激活：乙醇—IP3信號(hào)途徑---Ca2+升高3）Ca2+和Ca2+載體激活：A23187和CHX聯(lián)合應(yīng)用，可使胞內(nèi)Ca2+升高的同時(shí)，還可避免第二極體的排出。第六十九頁(yè)，共七十七頁(yè)，2022年，8月28日4）離子霉素激活離子霉素也是一種Ca2+載體，當(dāng)予CB、6-DMAP、CHX等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以有效激活重組胚的發(fā)育。5）Sr2+激活原理：Sr2+通過(guò)膜上鈣通道入胞，并進(jìn)入胞內(nèi)鈣庫(kù)，置換出內(nèi)源Ca2+，造成Ca2+