黑嘴蒲桃種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

T/CSMAXXXX－2018黑嘴蒲桃種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了黑嘴蒲桃[Syzygiumbullockii（Hance）Merr.&L.M.Perry]種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于黑嘴蒲桃種子的超低溫長(zhǎng)期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測(cè)定術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。黑嘴蒲桃Syzygiumbullockii（Hance）Merr.&L.M.Perry為桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃屬（SyzygiumGaertn.）常綠灌木至小喬木，圓錐花序頂生，多花，植株和番石榴一樣帶有桃金娘科特有的桉油味。以果實(shí)、根入藥，用于治療癆傷咳血、風(fēng)火牙痛、濕熱腹瀉、肝炎、風(fēng)濕痛、胃痛等。收載于《中國(guó)中藥資源志要（1994）》。黑嘴蒲桃果實(shí)Syzygiumbullockii（Hance）Merr.&L.M.Perryfruits大型果序，漿果或核果狀，橢圓形，紫黑色，長(zhǎng)約1cm，寬8mm。黑嘴蒲桃種子Syzygiumbullockii（Hance）Merr.&L.M.Perryseeds黑嘴蒲桃的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子黑褐色，橢圓狀卵形，表面光滑。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的黑嘴蒲桃種子置于液氮（-196℃）中保存。種子的選擇果實(shí)采收9月至11月，當(dāng)果皮顏色由綠轉(zhuǎn)為紫黑色時(shí)，即可采收，成熟的黑嘴蒲桃成一串串的，口味酸甜，汁多。去除果皮，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過3個(gè)月）。種子前處理生活力檢測(cè)參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中的溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法測(cè)定種子生活力。待測(cè)種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子50粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將含胚部分埋入凝膠中。將培養(yǎng)皿置于35℃溫箱中6h后觀察結(jié)果。生活力計(jì)算在光下用放大鏡對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡種胚周圍出現(xiàn)黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的黑嘴蒲桃種子生活力應(yīng)≥60%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹黑嘴蒲桃種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為3000:1，室溫條件下干燥處理0~80h，在干燥過程中定期測(cè)定種子含水量，將種子含水量由45%~55%降至38%~45%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測(cè)定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量黑嘴蒲桃種子保存量不少于360粒，以便后期的活力檢測(cè)使用。種子冷凍方式黑嘴蒲桃種子超低溫保存的冷凍方式為分步冷凍法，即將裝有種子和玻璃化保護(hù)溶液（PVS2）的15mL凍存管（每管30粒種子）置于4℃冰箱中0.5h，取出立即放入-20℃冰柜中1h，之后迅速投入液氮中保存。恢復(fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出2個(gè)凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍3min，而后用洗滌液（DS）浸泡3次，每次5min，并用純凈水沖洗干凈。凍后種子生活力檢測(cè)取出1管解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測(cè)方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測(cè)。當(dāng)種子生活力≥75%時(shí)視為保存成功?；謴?fù)培養(yǎng)將剩下1管解凍后的黑嘴蒲桃種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度25℃~30℃，濕度70%~85%條件下培養(yǎng)。附錄[1]BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.5g，溶解于煮沸過的500mL純水中。濾液若呈黃色，可加數(shù)滴氫氧化鈉溶液，使之變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，隨后加入3.5g瓊脂溶解，稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養(yǎng)皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。[2]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亞砜13.6mL，稱取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后，定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。注意：配置時(shí)需戴手套，并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。[3]洗滌液（DS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。參考文獻(xiàn)[1]中國(guó)藥材公司.中國(guó)中藥資源志要[M].XX，科學(xué)出版社，1994[2]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志委員會(huì).中國(guó)植物志.第53（1）卷[M].科學(xué)出版社，2004（1984）：097[3]ChenCheih，LynA.Craven.Myrtaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2007.13:3