多西環(huán)素對大鼠體外循環(huán)后肺內(nèi)MMP-9和TIMP-1

多西環(huán)素對大鼠體外循環(huán)后肺內(nèi)MMP-9和TIMP-1活性和基因表達的影響王常田程曉峰張雷吳海衛(wèi)許飚李德閩南京軍區(qū)南京總醫(yī)院心胸外科210002【摘要】目的：探討多西環(huán)素對大鼠體外循環(huán)后肺內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-９和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1活性和基因表達的影響。方法：健康雄性SD大鼠３６只隨機分為對照組（A組）、體外循環(huán)組（B組）和治療組（C組），分別于手術(shù)結(jié)束時（T1）和手術(shù)結(jié)束后6小時（T2）收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）和肺組織標本。Western-blot法測定BALF中MMP-9和TIMP-1的蛋白活性，RT-PCR法測定肺組織MMP-9和TIMP-1mRNA的表達。結(jié)果：治療組大鼠肺組織水腫減輕，BALF的中性粒細胞減少；CPB組BALF中MMP-9活性明顯升高，CPB后6小時表達最強，治療組MMP-9活性較CPB組有明顯下降，TIMP-1的活性在CPB組和治療組于CPB結(jié)束后呈較弱的增強趨勢，兩組間相同時間點的表達差異不明顯；CPB組和治療組MMP-9mRNA表達增強，但治療組MMP-9mRNA的表達在相應(yīng)時間點較治療組下降；TIMP-1mRNA在治療組表達增強，且T２時間點顯著增強；MMP-9/TIMP-1mRNA在CPB組和治療組均有顯著增大，但治療組中T2時間點組MMP-9/TIMP-1mRNA比值較CPB組明顯下降。結(jié)論：CPB可以引起大鼠術(shù)后肺內(nèi)MMP-9的活性和基因表達增強，導(dǎo)致術(shù)后早期肺內(nèi)MMP-9/TIMP-1mRNA表達失衡，多西環(huán)素可以抑制CPB后大鼠肺組織內(nèi)MMP-9蛋白水平和mRNA的表達，還可能上調(diào)TIMP-1的表達而間接抑制MMP-9mRNA表達，改善MMP-9/TIMP-1的比例失衡。【關(guān)鍵詞】基質(zhì)金屬蛋白酶-9，組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1，多西環(huán)素,體外循環(huán)EffectofdoxycyclineonMMP-9andTIMP-1activityandmRNAexpressioninlungaftercardiopulmonarybypasswitharatmodelWANGChangtian,CHENGXiaofeng,ZHANGLei,WUHaiwei,XUBiao,LIDeminDepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery,NanjingGeneralHospitalofNanjingCommand,Nanjing210002【Abstract】Objective:ThisstudywasaimedtoinvestigatetheeffectofdoxycyclineontheactivityandmRNAexpressionofMMP-9andTIMP-1inCPBbyaratmodel.Methods:MaleSprague-Dawleyratswererandomlydividedinto3groups(n=12,respectively):shamgroup,CPBgroup,andCPB+Doxgroup.TheratswereexecutedattheterminationofCPB(T1),6hafterterminationofCPB(T2)respectively.BALFandlungtissueswereharvestedatT1andT2.Thelungwet/dryratio(W/D)wasmeasured.NeutrophilinBALFwascounted.TheactivityofMMP-9andTIMP-1wasdetectedbyWestern-blotanalysis.TheexpressionofMMP-9andTIMP-1inlungtissuewasdetectedbyRT-PCR.Results:TheedemaoflungtissuesignificantlyreducedinCPB+DoxgroupcomparedwithCPBgroup,andneutrophilswerelessthanCPBgroup.TheactivityofMMP-9byWestern-blotinCPB+DoxgroupdecreasedsignificantlycomparedwithCPBgroupandtheactivityofTIMP-1wasaweakerincreasingtrendinCPBandCPB+Doxgroup.TheexpressionofMMP-9mRNAbyRT-PCRwassignificantlyincreasedafterCPBinCPBandCPB+Doxgroup,butsignificantlydecreasedatT2timepointinCPB+Doxgroup.TheratioofMMP-9/TIMP-1wassignificantlyincreasedinCPBandCPB+Doxgroup,butinCPB+DoxgroupwassignificantlylowerthaninCPBgroupatT2time.Conclusions:CPBcouldinducetheactivityandmRNAofMMP-9oflungincreased,causingtheratioofMMP-9/TIMP-1imbalancedseverelyattheearlypostoperative.DoxycyclinecouldinhibittheexpressionofMMP-9activityandmRNAinratlungtissueafterCPB,andmightincreasetheexpressionofTIMP-1inratsafterCPB,andinhibittheexpressionofMMP-9mRNAindirectly,whichcouldimprovetheratioofMMP-9/TIMP-1imbalance.【KeyWords】MatrixMetalloproteinase-9，Tissueinhibitorofmetalloproteinases-1,Doxycycline,CardiopulmonaryBypass體外循環(huán)(Cardiopulmonarybypass,CPB)可以導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)，急性肺損傷（Acutelunginjury,ALI）是主要并發(fā)癥之一[１]，基底膜的損傷和修復(fù)在ALI發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinase，MMP）是參與細胞外基質(zhì)降解的主要酶類，MMP-9主要來源于炎性細胞，其作用底物主要是Ⅳ、Ⅴ型膠原，與ALI有關(guān)[3]。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)是內(nèi)源性MMPs抑制劑，在皮摩爾水平對MMPs就有很好的親和性，是一種理想的抑制劑。近年來在ALI過程中MMPs/TIMPs的失衡逐步受到研究者的重視[4]，但在CPB所致ALI過程中的研究較少。本實驗通過建立大鼠體外循環(huán)動物模型，從支氣管肺泡灌洗液蛋白活性、肺組織mRNA等不同水平觀察MMP-9和TIMP-1在體外循環(huán)術(shù)后肺內(nèi)的表達，探討MMP-9和TIMP-1在CPB所致ALI中的作用及可能機制。１、材料和方法１.１大鼠體外循環(huán)建立清潔級健康純種成年雄性SD大鼠，體重500-600g，月齡5-6個月，在SPF級動物屏障環(huán)境下飼養(yǎng)。溫度22℃，相對濕度50%-60%，分籠飼養(yǎng)，予以標準飼料，自由取水。南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供，實驗動物許可證明號：SYXK（軍）2007-029。術(shù)前24小時禁食，自由飲水。2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后仰臥、固定于操作臺，四肢接心電導(dǎo)聯(lián)，股動脈穿刺動態(tài)監(jiān)測血壓，尾動脈穿刺連接動脈泵管，右側(cè)頸內(nèi)靜脈置帶網(wǎng)狀側(cè)孔的16G導(dǎo)管作靜脈引流并接貯血槽。所有管路妥善固定于體表。預(yù)充液按晶膠比1:4配制，膠體選用賀斯，預(yù)充量10ml[5]。１.２實驗設(shè)計36只大鼠隨機分為3組，每組12只。A組（對照組，sham）：僅進行麻醉，股動脈、尾動脈和頸靜脈插管及肝素化等處理，不進行體外循環(huán)；B組（體外循環(huán)組，CPB）:麻醉、動靜脈插管及肝素化后進行體外循環(huán)。體外循環(huán)時間60min，術(shù)中維持收縮壓在75-120mmHg，體外循環(huán)過程中不降溫、不給地塞米松及烏司他丁等藥物。C組（體外循環(huán)+藥物，CPB+Dox）：術(shù)前1周開始予以多西環(huán)素（Dox）30mg/kg進行灌胃治療，每天1次，7天后接受CPB。分別于手術(shù)結(jié)束時（T1）和手術(shù)結(jié)束后6小時（T2）處死大鼠，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）和肺組織標本，對照組分別在相應(yīng)時間點取材。１.３標本的收集和保存：按預(yù)定時間點處死各組大鼠，打開胸腔完整取出心肺，取右上肺置于-75℃冰箱凍存，用于測定MMP-9和TIMP-1mRNA的表達。左肺組織先稱濕重，然后用4℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，每次灌洗量為2ml，共4次，收集灌洗液并記錄回收量，BALF以3000r/min離心10min，取上清液保存于-75℃凍存待用；離心后沉淀用1ml生理鹽水稀釋，進行中性粒細胞計數(shù)。左肺灌洗結(jié)束后，置于烤箱中60℃干燥至恒重，稱取干重。１.４Western-blot法測定BALF中MMP-9及TIMP-1的蛋白活性提取BALF中總蛋白；將30μg蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯氟化物膜，然后與1:1000Ⅰ抗溶液反應(yīng)（羊抗鼠MMP-9和TIMP-1多克隆抗體）；漂洗后再與1:2000辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗（兔抗羊IgG）孵育2h；與NEN化學發(fā)光試劑反應(yīng)3～5min，暗盒中使X光片曝光10～30sec，經(jīng)顯影定影后，凝膠掃描成像系統(tǒng)分析目的條帶。ImageJ分析程序軟件進行電腦推算法測定與內(nèi)參β-actin灰度比值，重復(fù)3次取平均值。１.5RT-PCR法測定肺組織MMP-9/TIMP-1mRNA的表達TRIzol法提取RNA，具體方法按其說明進行。采用NCBI/Primer-BLAST設(shè)計PCR引物。?。郸蘥RNA、OligoDt（18）1.5μL和無核酸酶的雙蒸水加入0.2ml滅菌無核酸酶PCR管至總體積10μL在70℃保溫10min，然后加入RNase抑制劑(40u/μL)0.5μL、10×AMVReactionBuffer2.5μL、dNTPs(10mM)1μL、DTT(1M)1.5μL、逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV）1μL、無核酸酶的雙蒸水8.5μL，混勻后2000rpm離心20s；42℃保溫45min，然后72℃保溫10min，即進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為2X的RTmix10μl、模板（cDNA稀釋10倍）1μl、引物F和R5pmol/ulmix2μl、無核酸酶的雙蒸水7μl，總共20μl。放置樣品于循環(huán)儀并啟動熱循環(huán)，進行４０循環(huán)的擴增（DA7600），每個熱循環(huán)包括95℃25秒，60℃30秒，72℃30秒，最后72℃保溫10分鐘，PCR反應(yīng)完成后，采用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，大鼠的MMP-9和TIMP-１基因表達采用MMP-９和TIMP-１與β-actin的光密度比值表示。1.6統(tǒng)計學分析計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，組間均數(shù)比較采用方差分析法。p＜0.05為差異有顯著統(tǒng)計學意義。２.結(jié)果２.１三組大鼠手術(shù)后肺的W/D值和BALF中性粒細胞數(shù)三組大鼠術(shù)后W/D值和BALF中性粒細胞數(shù)見表１。各組之間差異明顯，在T２時間點，Ｂ組的W/D值明顯高于A組和C組(8.9±0.9vs4.0±0.3,5.6±0.8,p<0.01)。而C組則介于A組和B組之間，明顯低于B組而高于A組，之間有顯著差異（4.5±0.7,5.6±0.8vs6.7±0.8,8.9±0.9,p<0.05；4.5±0.7,5.6±0.8vs3.6±0.4,4.0±0.3,p<0.05）。中性粒細胞變化趨勢與W/D值一致。表１肺的W/D值和BALF中性粒細胞數(shù)Table1TheratiooflungW/DandneutrophilscountsinBALFGroupＡGroupＢGroupＣT1(n=6)T2(n=6)T1(n=6)T2(n=6)T1(n=6)T2(n=6)W/D3.6±0.44.0±0.36.7±0.8*8.9±0.9*4.5±0.7▲5.6±0.8▲Neutrophils4.5±0.34.7±0.510.7±1.2*13.9±1.9*8.6±0.9▲10.9±1.1▲(×109/L)數(shù)值以mean±SD表示，GroupA（對照組）GroupB（CPB組）GroupC（CPB+Dox組）T1，手術(shù)結(jié)束時；T2，和手術(shù)結(jié)束后6小時W/D，肺的濕/干重比值BALF，bronchoalveolarlavagefluid*p<0.01B組與A組相比；▲p<0.05C組與B組相比。２.２BALF中MMP-9和TIMP-１活性測定Western-blot法測定三組大鼠BALF中的MMP-9和TIMP-１活性（表２和圖1），結(jié)果顯示B組中MMP-9的活性在兩個時間點均明顯高于A組和C組(T11.04±0.06vs1.19±0.09,1.09±0.04p<0.01；0.86±0.01vs1.14±0.04,1.11±0.11p<0.01)。而A組和C組之間無顯著差異。TIMP-１的活性改變類似于MMP-9，B組的TIMP-１活性明顯高于A組和C組。表２Western-blot法測定三組大鼠BALF中的MMP-9和TIMP-１活性Table2TheactivityofMMP-9andTIMP-1inBALFbyWestern-blotanalysisgroupAgroupBgroupCT1(n=6)T2(n=6)T1(n=6)T2(n=6)T1(n=6)T2(n=6)MMP-91.19±0.091.14±0.041.04±0.06*0.86±0.01*1.09±0.041.11±0.11TIMP-11.15±0.081.08±0.021.11±0.12△1.01±0.09△1.13±0.120.98±0.02數(shù)值以mean±SD表示，GroupA（對照組）GroupB（CPB組）GroupC（CPB+Dox組）T1，手術(shù)結(jié)束時；T2，和手術(shù)結(jié)束后6小時MMP-9,matrixmetalloproteinase-9;TIMP-1,tissueinhibitorofmetalloproteinase-1.*p＜0.01B組與A組和C組相比;△p＜0.05B組A組和C組相比;MMP-9TIMP-1MMP-9TIMP-1AT1AT2BT1BT2CT1CT2圖１Western-blot法測定大鼠BALF中的MMP-9和TIMP-１活性Figure１TheactivityofMMP-9andTIMP-1inBALFbyWestern-blotanalysisGroupA（對照組）GroupB（CPB組）GroupC（CPB+Dox組）T1，手術(shù)結(jié)束時；T2，和手術(shù)結(jié)束后6小時MMP-9,matrixmetalloproteinase-9;TIMP-1,tissueinhibitorofmetalloproteinase-1.２.３肺組織MMP-9和TIMP-１mRNA的測定對肺組織內(nèi)MMP-9、TIMP-1mRNA進行RT-PCR測定，結(jié)果見圖2。三組MMP-9mRNA兩個時間的表達分別為0.96±0.23,1.09±0.24,4.90±0.90,10.03±1.16,3.51±0.49,和8.87±1.20。其中B組中MMP-9mRNA的表達在T2時間點與其他兩組相比達到峰值(p<0.001)。三組TIMP-1mRNA的表達值分別為0.91±0.20,1.09±0.31,3.08±0.63,4.02±0.87,3.11±0.91,和4.62±0.85。其中B組和C組的TIMP-1mRNA在兩個時間點均明顯增強，與A組相比有顯著差異，但兩組之間無顯著差異。MMP-9/TIMP-1mRNA表達的比值在三組中分別為1.06±0.16,1.07±0.25,1.62±0.34,2.59±0.66,1.17±0.21和1.94±0.19。其中B組中比值明顯高于其他兩組，有意義的是C組較B組在兩個時間點均明顯下降，表明在C組中MMP-9的增強得到了抑制，增長的幅度不及TIMP-1的增長，所以比值出現(xiàn)下降趨勢。Figure2MMP-9andTIMP-1geneexpressionbyusingTR-PCT.數(shù)值以mean±SD表示，GroupA（對照組）GroupB（CPB組）GroupC（CPB+Dox組）。*p<0.01表示顯著差異。T1，手術(shù)結(jié)束時；T2，和手術(shù)結(jié)束后6小時MMP-9,matrixmetalloproteinase-9；TIMP-1,tissueinhibitorofmetalloproteinase-1.３．討論體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)開展以來，術(shù)后肺功能障礙一直受心外科醫(yī)師、體外循環(huán)醫(yī)師及重癥監(jiān)護醫(yī)師的共同關(guān)注，并積極探索其發(fā)生發(fā)展的機制以及防治方法以抑制或減輕其反應(yīng)程度。目前國內(nèi)外學者對其基本病理改變的比較共同的認識是體外循環(huán)過程激活了各種炎癥因子繼而損傷肺泡毛細血管基底膜，從而引起肺泡內(nèi)液體增多，肺內(nèi)分流增加，影響氣體交換[6]。在本研究中，大鼠經(jīng)CPB后肺水增加，支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞明顯增多，存在不同程度的急性肺損傷。肺泡基底膜的成份包括有Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白等，致其損害必須有蛋白水解酶的參與，因此MMPs作為具有降解基底膜功能的酶類在各種原因所致急性肺損害的作用越來越受人們的關(guān)注。本研究中CPB后大鼠的BALF中MMP-9的活性明顯增加，肺內(nèi)MMP-9mRNA的表達亦明顯增強。表明CPB通過各種途徑激活了MMP-9的表達并促進中性粒細胞肺內(nèi)遷移和肺泡毛細血管通透性增加[7]。作為MMPs的內(nèi)源性抑制劑，TIMPs最初被認為主要調(diào)節(jié)MMPs活性，抑制細胞外基質(zhì)更新，而目前研究發(fā)現(xiàn)其具有多重功能，可以直接通過細胞表面受體或間接通過調(diào)節(jié)蛋白酶活性而起作用，如TIMP-2結(jié)合于整合素α3β1是TIMP家族成員首次作用于細胞表面受體的描述；TIMP-1則結(jié)合于CD63而抑制細胞生長和凋亡[8]。在本研究中發(fā)現(xiàn)CPB后大鼠肺內(nèi)TIMP-1的活性和基因表達均明顯增強。通過采用多西環(huán)素作為外源性MMPs抑制進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)治療組支氣管肺泡灌洗液MMP-9活性及肺組織內(nèi)MMP-９基因表達受到抑制，說明多西環(huán)素可以抑制CPB后肺組織內(nèi)MMP-9蛋白水平和mRNA的表達。肺組織內(nèi)TIMP-1mRNA的表達在CPB組內(nèi)兩時間點未見顯著差異,但在治療組內(nèi)可見CPB結(jié)束后6小時較CPB結(jié)束時TIMP-1mRNA的表達明顯增強，兩者間有顯著差異，說明多西環(huán)素可能促進大鼠肺內(nèi)TIMP-1mRNA的表達，提高CPB后肺內(nèi)TIMP-1的含量，從而間接抑制MMP-9的活性和表達。通過對MMP-9和TIMP-1mRNA表達的比值進一步分析，在CPB組和治療組內(nèi)相比，CPB后MMP-9/TIMP-1均有顯著增大，表明兩組內(nèi)CPB后肺內(nèi)MMP-9mRNA表達的增長幅度明顯大于TIMP-1mRNA的增長，CPB過程對MMP-9的刺激或激活作用遠大于TIMP-1，造成MMP-9和TIMP-1表達的比例嚴重失衡。CPB組和治療組在CPB結(jié)束時MMP-9/TIMP-1差異不明顯，而在CPB結(jié)束后6小時治療組的MMP-9/TIMP-1較CPB組有顯著下降，說明治療組在CPB結(jié)束以后肺內(nèi)MMP-9表達受到抑制，而同時TIMP-1表達反而上調(diào)，MMP-9/TIMP-1比值的下降說明MMP-9/TIMP-1的比例嚴重失衡得到有效控制或逆轉(zhuǎn)。通過本研究證實多西環(huán)素在大鼠CPB過程中具有明顯的MMP-9的抑制作用，結(jié)合文獻[9、10、11、12]分析其可能機制：1、通過對MMP-9的金屬離子的絡(luò)合作用直接抑制MMP-9活性；2、減少中性粒細胞肺內(nèi)扣押，減少MMP-9的釋放；3、可能通過上調(diào)內(nèi)源性抑制劑如TIMP-1的水平而抑制MMP-9活性及表達；4、通過抑制細胞因子的轉(zhuǎn)錄，間接抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄、活化、激活；5、可能通過上調(diào)肺內(nèi)其他蛋白或細胞因子水平而抑制MMP-9。眾多研究已經(jīng)證實，多西環(huán)素對MMP-9的抑制可能并非通過單一途徑進行，而是多種途徑的綜合作用。具體機制尚需進一步深入研究，尤其要充分認識MMPs前體的激活和錨合等機制，也許能夠提供一種方法來抑制潛在而有害的MMPs激活相關(guān)過程而保留其有益功能。參考文獻：LevyJH,TanakaKA.Inflammatoryresponsetocardiopulmonarybypass.AnnThoracSurg.2003Feb;75(2):S715-20M.Corbel,E.BoichotandV.LagenteRoleofgelatinasesMMP-2andMMP-9intissueremodelingfollowingacutelunginjury.BrazilianJournalofMedicalandBiologicalResearch.200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