高效液相色譜法測(cè)定甘草苷和甘草酸含量的研究(精)-2022122122394217

高效液相色譜法測(cè)定甘草苷和甘草酸含量的爭(zhēng)辯【摘要】 目的建立甘草昔和甘草酸的HPLC含量測(cè)定方法。方法使用KromasiL-C18(4.6mmx200mm,511m)柱，甘草昔接受乙睛-0.5%醋酸(20:80)為流淌相，檢測(cè)波長(zhǎng)276nm，柱溫為室溫；甘草酸流淌相為甲醇-0.2mol?L-1乙酸銨溶液-冰乙酸(67：32：1)，檢測(cè)波長(zhǎng)252nm,柱溫為室溫。二者流速均為1.0ml?min-1,接受外標(biāo)法定量測(cè)定。結(jié)果甘草昔在2.7_271g?ml-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0.9997);甘草酸在6_36”g?ml-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0.9998);甘草昔和甘草酸的平均回收率分別為101.4%和101.3%，其RSD值分別為1.18%和1.22%。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，線性相關(guān)系數(shù)良好，且穩(wěn)定性和重復(fù)性好，適用于甘草黃酮粗提物及純化物中甘草昔和甘草酸的含量測(cè)定。 【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜；甘草昔；甘草酸Abstract:ObjectiveToestablishmethodfordeterminationofliquiritinandglycyrrhizicacidbyHPLC.MethodsKromasil-C18column(4.6mmx200mm,51m)wasused,HPLCanalysisforliquiritinwasperformedwithroomtemperatureandthemobilephaseconsistedofacetonitrile-0.5%glacialaceticacid(20：80),thedetectionwavelengthwasat276nm;HPLCanalysisglycyrrhizicacidwasperformedwithroomtemperatureandthemobilephaseconsistedofmethanol-0.2mol?LTammoniumacetate-glacialaceticacid(67：32：1),thedetectionwavelengthwasat252nm.Theflowratewas1.0ml?minT.ResultsThelinearrangeofliquiritinwasobtainedbetween2.727“g?mlT(r=0.9997);thelinearrangeofglycyrrhizicacidwasobtainedbetween636“g?mlT(r=0.9998);theaveragerecoveryofliquiritinandglycyrrhizicacidwere101.4%and101.3%respectivelywithcorrespondingRSDof1.18%and1.22%.ConclusionThismethodissimple,convenientstable,repeatableandaccuratewithgoodlinearrelationship.Itissuitableforthedeterminationofliquiritinandglycyrrhizicacidinextractionandpurificationoflicoriceflavonoid.Keywords:HPLC;Liquiritin;Glycyrrhizicacid甘草是新疆隱藏量大、藥用價(jià)值高的一種荒漠草原藥用植物，其主要有效成分為甘草酸和黃酮類(lèi)化合物。甘草黃酮具有明顯的抗腫瘤、抗?jié)?、抗菌、抗變態(tài)反應(yīng)、降血脂和鎮(zhèn)痛的作用，并對(duì)愛(ài)滋病病毒有很強(qiáng)的抑制增殖作用［1,2］,是甘草有效成分開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。經(jīng)典的黃酮含量測(cè)定方法，是以蘆丁為對(duì)比品，接受紫外分光光度法測(cè)定［3一5］，但此方法用于甘草黃酮的測(cè)定尚有諸多不足之處。甘草黃酮的主要成分甘草昔，是反映甘草黃酮內(nèi)在質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)［6］。本爭(zhēng)辯以甘草昔為對(duì)比品，接受HPLC法測(cè)定甘草黃酮含量的方法，同時(shí)爭(zhēng)辯優(yōu)化以HPLC測(cè)定甘草酸含量的方法，以期為甘草有效成分的綜合 開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量監(jiān)控供應(yīng)新的方法和思路。1儀器與材料 1.1儀器LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；SPD-10A可變紫外檢測(cè)器（日本島津）；萬(wàn)分之一天平（Sartorius）;KQ-250B型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）。 1.2材料甘草（石河子天德中藥廠）。甘草苷對(duì)比品、甘草酸單銨鹽對(duì)比品（均購(gòu)自藥品生物制品檢定所）；95%乙醇（A.R）、冰醋酸（A.R）、乙酸胺（A.R）、甲醇（色譜純）、乙睛（色譜純）。2方法與結(jié)果2.1色譜分析條件 甘草苷檢測(cè)條件色譜柱為KromasiL-C18（4.6mmx200mm,5ixm）;流淌相為乙睛-0.5%醋酸（20：80）;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm;流速1.0ml?min-1;柱溫為室溫；進(jìn)樣量20“1。理論塔板數(shù)按甘草酸銨峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。對(duì)比品和甘草黃酮粗提物的色譜圖見(jiàn)圖1一2。甘草酸檢測(cè)條件色譜柱為KromasiL-C18（4.6mmx200mm,5xm）;流淌相為甲醇-0.2mo1?L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67：32：1）;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)252nm;流速1.0m1?minT;柱溫為室溫；進(jìn)樣量20“1。理論塔板數(shù)按甘草酸銨峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。對(duì)比品和甘草黃酮粗提物分別的色譜圖見(jiàn)圖3-4。2.2對(duì)比品及供試品溶液的配制 2.2.1對(duì)比品溶液的配制取甘草苷和甘草酸單銨鹽對(duì)比品適量，精密稱(chēng)定，用流淌相配制成濃度為54xg*m1-1的甘草苷對(duì)比品溶液和120“g?m1-1的甘草酸單銨鹽對(duì)比品溶液。 2.2.2供試品溶液的制備精密稱(chēng)取甘草黃酮提取物適量，用相應(yīng)的流淌相溶解，定溶于10ml量瓶中，作為甘草苷供試品溶液。精密稱(chēng)取甘草黃酮提取物適量，用相應(yīng)的流淌相溶解，定溶于10ml量瓶中，作為甘草酸供試品溶液。 2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇以流淌相為參比溶液，在200一400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別對(duì) 甘草苷和甘草酸對(duì)比品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，甘草苷在276nm處有一最大吸取峰，甘草酸在252nm處有一最大吸取峰，所以選定276nm為甘草苷的檢測(cè)波長(zhǎng)，252nm為甘草酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。2.4線性關(guān)系的考察精密吸取甘草苷對(duì)比品儲(chǔ)備液0.50,1.00,2.00,3.00，4.00，5.00ml于10ml量瓶中，用20%乙睛定容至刻度，搖勻；再精密吸取甘草酸單銨鹽對(duì)比品儲(chǔ)備液0.50,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00ml于10ml量瓶中，用流淌相定容至刻度，搖勻；分別按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積A（“V?s）對(duì)進(jìn)樣濃度C（“g?ml-1）作回歸統(tǒng)計(jì)，結(jié)果：甘草苷在2.7_27xg?ml-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程：A=24962C+7161.1,r=0.9997。 甘草酸在6_36“g?ml-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：A=23653C+23125,r=0.9998。 2.5精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得甘草苷的RSD為0.74%,甘草酸的RSD為0.92%,說(shuō)明本方法精密度良好。2.6重復(fù)性試驗(yàn)按“2.2.2”項(xiàng)制備同一批號(hào)供試品溶液6份，按擬定的色譜條件分別測(cè)定甘草苷和甘草酸的含量，測(cè)得甘草苷的RSD為1.32%,甘草酸的RSD為1.04%，表明重復(fù)性較好。2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)配制同一供試品溶液，分別在0,2,4,6,8,10,12,24,36,48h后進(jìn)樣，求得甘草苷的RSD為1.44%,甘草酸的RSD為0.89%,表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。 2.8回收率試驗(yàn)取已知含量的同一供試品溶液各5份，分別精密加入同一濃度同一體積的甘草苷對(duì)比品溶液，甘草酸單銨鹽對(duì)比品溶液，混勻，進(jìn)樣，按上述方法測(cè)定甘草酸和甘草苷的含量，測(cè)得甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為101.4%,101.3%；RSD值分別為1.18%,1.22%。表明本試驗(yàn)所確定的HPLC法進(jìn)行甘草苷和甘草酸的含量分析，精確?????度較高。結(jié)果見(jiàn)表1。表1甘草酸和甘草 苷的回收率試驗(yàn)結(jié)果 2.9樣品測(cè)定分別精密稱(chēng)定甘草黃酮粗提物和純化物各3份，適量，按 “2.2.2”項(xiàng)方法制備所需的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件分別測(cè)定甘草苷和甘草酸的峰面積，計(jì)算甘草黃酮粗提物（烘干樣）中甘草苷和甘草酸的純度分別為3.68%和18.38%,甘草黃酮純化物（烘干樣）中甘草苷的純度為17.29%，未檢測(cè)到甘草酸。結(jié)果見(jiàn)表2。甘草黃酮純化物分別的色譜圖見(jiàn)圖5。表2樣品測(cè)定結(jié)果 測(cè)定項(xiàng)甘草黃酮粗提物123平均值RSD甘草黃酮純化物123平均值RSD甘草酸 純度18.2518.5118.3918.380.71 甘草苷純度3.623.733.693.681.5117.1617.3117.4017.290.70“-”為未檢測(cè)到3爭(zhēng)辯 3.1甘草苷流淌相的選擇考察了選用不同比例的乙睛-0.5%醋酸為流淌相時(shí)對(duì) 甘草苷的保留時(shí)間及分別度的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，以乙睛-0.5%醋酸（10：90）為流淌相時(shí)，保留時(shí)間短，但峰形較差，乙睛比例增大后峰形變得較尖銳對(duì)稱(chēng)，響應(yīng)值顯著增大，分別度漸漸改善，保留時(shí)間先增大后縮短，當(dāng)乙睛比例大于20%后，未檢測(cè)到甘草苷，綜合考慮，選用乙睛-0.5%醋酸（20：80）為流淌相，甘草苷的保留時(shí)間適中，分別效果好。 3.2甘草酸流淌相的選擇本試驗(yàn)分別選用不同比例的甲醇-2%乙酸，甲醇-0.2mol?L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67：32：1）為流淌相，試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇-2%乙酸（73：27）和甲醇-0.2mol?L-1乙酸銨溶液-冰乙酸（67：32：1）為流淌相時(shí)，分別效果均較好，但在流淌相的穩(wěn)定性和分析時(shí)間的合理性方面，后者更優(yōu)越，因此選用甲醇-0.2mol?L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67：32：1）為流淌相。 按本法分別對(duì)甘草苷和甘草酸進(jìn)行高效液相色譜分析，具有回收率和線性相關(guān)系數(shù)良好，操作簡(jiǎn)便，快速，樣品用量少，精密度和重復(fù)性好，自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于甘草黃酮粗提物及純化物中甘草苷和甘草酸的質(zhì)量把握，具有廣泛的應(yīng)用前景。【參考文獻(xiàn)】 邢國(guó)秀，李楠，王童，等.甘草中黃酮類(lèi)化學(xué)成分的爭(zhēng)辯進(jìn)展[J].中藥雜志，2003,28（7）:593. 從景香，高麗娟，林炳昌，等.甘草黃酮類(lèi)化合物爭(zhēng)辯進(jìn)展