核酸的研究方法課件

第15章核酸的研究方法第15章核酸的研究方法1核酸的分離、提純和定量測定核酸的超速離心核酸的凝膠電泳核酸的核苷酸序列測定DNA聚合酶鏈式反應（PCR）DNA的化學合成核酸的分離、提純和定量測定核酸的超速離心核酸的凝膠電泳核酸的2

制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測定制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免3真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl），據此，細胞破碎后采用高鹽提取，低鹽沉淀，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。去除蛋白質：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化也可用SDS破碎細胞，蛋白酶K降解蛋白后，苯酚抽提，再用RNase分解除去RNA而獲得純化的DNA。（一）DNA分離純化也可用SDS破碎細胞，蛋白酶K降解蛋白后4制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：①容器用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。然后經過高溫處理。DEPC能使蛋白質乙基化而破壞RNase活性；②加入強變性劑（如胍鹽：可使所有蛋白質變性）使RNase失活；③在RNA的反應體系內加入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：（二）RNA的分離5①用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。鹽酸胍、苯酚等去蛋白②用酸性胍鹽/苯酚/氯仿抽提：異硫氰酸胍是極強的蛋白質變性劑。后用苯酚和氯仿多次除凈蛋白質③用胍鹽/氯化銫將細胞抽提物進行密度梯度離心，蛋白質在最上面，DNA在中間，RNA沉在底部★mRNA的制備：oligo(dT)纖維素（瓊脂糖凝膠）親合層析法

制備RNA的方法：①用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即為R6（三）核酸含量的測定2、定糖法RNA：核糖→糠醛→→綠色物質（670-680nm）DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個A～50μg/ml雙鏈DNA～40μg/mlRNA或單鏈DNA（三）核酸含量的測定2、定糖法苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸173、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當于10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成復合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光熒光強度與DNA含量成正比3、定磷法8細胞或組織中核酸含量測定方法生物組織酸溶性物質殘留物冷的稀酸抽提脂類物質殘留物熱酸法冷酸法堿法殘留物酸抽提液(RNA+DNA)熱酸提取殘留物殘留物酸抽提液(DNA)熱酸提取酸抽提液(RNA)冷酸提取酸抽提液(RNA)殘留物(DNA)有機溶劑抽提堿降解再酸化細胞或組織中核酸含量測定方法生物組織酸溶性物質殘留物冷的稀酸9純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260／OD280純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染（四）、核酸10二、核酸的沉降特性與超速離心

利用超離心技術，可以測定核酸的沉降常數和相對分子質量。密度梯度沉降平衡超離心法在核酸分子構象的研究中應用頗廣。DNA分析時，常用氯化銫密度梯度。主要應用于以下方面：核酸密度的測定測定DNA中的G-C含量溶液中核酸構象的研究用于核酸的制備二、核酸的沉降特性與超速離心利用超離心技術，可118MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：未知DNA的密度ρ0：為標準DNA的密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉軸的距離r0：已知DNA到轉軸的距離（一）核酸密度的測定8MCsCl，45000rpm，16h（一）核酸密度的測定12G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系，因此可用能用該方法計算DNA堿基成分，計算公式為：ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10需注意的是：含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其實際浮力密度會降低，低于理論值，不能用該公式計算。（二）測定DNA的G-C含量G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系，因此可用能用該方13RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構象RNA＞DNA（三）研究核酸的構象14（四）用于核酸的制備不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA與蛋白質區(qū)分開來，利用EB（溴化乙錠）與核酸結合，能在紫外燈下發(fā)出熒光的特性，將目的區(qū)帶收集。（四）用于核酸的制備不同構象的核酸（線形、環(huán)15是當前核酸研究中最常用的方法。有許多的優(yōu)點：簡單、快速、靈敏、成本低。常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用于大片段DNA或RNA的分離，精度低，但分離范圍廣。是當前核酸研究中最常用的方法。有許多的優(yōu)點：簡單、快速、靈敏16電泳遷移率決定于：（1）核酸分子的大?。ㄟw移率與相對分子質量對數成反比）（2）膠濃度（遷移率與膠濃度成反比，常用0.7～1%）（3）DNA的構象：超螺旋＞線狀分子＞開環(huán)狀分子（4）電壓（一般5V/cm,電壓與遷移率成正比)（5）堿基組成（影響不大）（6）溫度（4～30℃都可以，常室溫進行）

瓊脂糖凝膠電泳常用于DNA分析；分析RNA時需加入蛋白質變性劑甲醛。電泳完畢用溴化乙錠（0.5μg/mL）染色，用紫外光檢測電泳遷移率決定于：17第15章核酸的研究方法課件18★瓊脂糖電泳用于DNA分子量的測定在同一凝膠中加入已知相對分子質量的樣品（分子marker)，在電泳完成后，通過染色，照相，從照片上比較待測樣品的DNA片段與標準樣品的中的已知大小片段，可以推測待測未知DNA片段的分子大小。★瓊脂糖電泳用于DNA分子量的測定在同一凝膠中加入已知相對分19用于小片段DNA的分析相對分子質量小于1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析時不會分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）用于小片段DNA的分析（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）20（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定英國Sanger1955確定牛胰島素結構，1958獲諾貝爾化學獎1975設計出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學獎合成一系列與待測DNA序列互補的DNA片段群。

（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定英國Sa21第15章核酸的研究方法課件22末端終止法——Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。末端終止法——Sanger23第15章核酸的研究方法課件24第15章核酸的研究方法課件25DNA序列分析儀：四色熒光基團標記的dNTPDNA序列分析儀：26（二）DNA的化學法測序：由Maxam和Gilbert所發(fā)明。其基本原理是用特異的化學試劑作用于DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應，可使末端標記的DNA分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜

（二）DNA的化學法測序：由Maxam和Gilbert所發(fā)明274組特異的反應如下：（1）G反應：用硫酸二甲酯DMS使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂（2）G+A反應：用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂（3）T+C反應：用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基（4）C反應：當有鹽存在時，只有C與肼反應，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂4組特異的反應如下：28（三）RNA的測序RNA的測序方法有3個：（1）用酶特異切斷RNA鏈：胰RNaseA：嘧啶核苷酸鍵米曲霉RNaseT1：鳥苷酸核苷酸鍵黑粉菌RNaseU2：腺苷酸核苷酸鍵多頭黏菌RNasePhyI：A、G、U核苷酸鍵（2）用化學試劑裂解RNA（與DNA化學測序法類似）（3）逆轉錄成cDNA（三）RNA的測序291995年K.Mullis發(fā)明?；静襟E為：1.設計一對引物以便有效擴增所需要的DNA序列，并盡量減少可能產生的非特異產物2.優(yōu)化反應體系：包括適量模板、引物、4種dNTP、耐高溫的DNA聚合酶和適量Mg2+五、DNA聚合酶鏈式反應（PCR）1995年K.Mullis發(fā)明。基本步驟為：五、DNA聚合酶303.選擇3個溫度進行熱循環(huán)：變性94℃，45－60s；退火，根據引物的Tm，一般為兩引物中較低的Tm值減2，1min；延伸，72℃，1min。熱循環(huán)25-30個周期，最后延伸10分鐘。4.擴增完成后取出一定量的反應產物，檢測擴增結果：先進行凝膠電泳，用溴化乙啶染色，紫外光下檢測結果3.選擇3個溫度進行熱循環(huán)：31y=產物；x=擴增效率；n＝循環(huán)次數PCR技術十分靈敏，擴展效率非常高，通常可擴增106倍，其擴增產量可按下列公式計算。y=產物；x=擴增效率；n＝循環(huán)次數PCR技術十分靈敏，擴展32第15章核酸的研究方法課件33溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應的溫度循環(huán)周期如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。溫度（℃）時間（min）9494℃變性（1min）60℃退34PCR技術的應用-：（1）遺傳病和某些疑難病的診斷以及孕婦的產前檢查（2）病原體的檢測（3）法醫(yī)和刑偵鑒定（4）癌基因的檢查（5）基因組探針的制備（6）基因組測序、染色體巡視（7）cDNA庫的構建（8）基因突變的分析和定位誘變（9）DNA重組（10）基因的分離和克隆PCR技術的應用-：35六、DNA的化學合成P521圖15-6固相合成法（亞磷酸三酯法）合成DNA合成方向：3’→5’端5’-OH用二對甲氧三苯甲基（DMT）保護。3’-OH用氨基亞磷酸化合物活化堿基上氨基用苯甲酸保護六、DNA的化學合成P521圖15-6固相合成法（亞磷酸三酯36二對甲氧三苯甲基二對甲氧三苯甲基37第15章核酸的研究方法課件38第15章核酸的研究方法課件39第15章核酸的研究方法課件40第15章核酸的研究方法課件41第15章核酸的研究方法第15章核酸的研究方法42核酸的分離、提純和定量測定核酸的超速離心核酸的凝膠電泳核酸的核苷酸序列測定DNA聚合酶鏈式反應（PCR）DNA的化學合成核酸的分離、提純和定量測定核酸的超速離心核酸的凝膠電泳核酸的43

制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測定制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免44真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl），據此，細胞破碎后采用高鹽提取，低鹽沉淀，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。去除蛋白質：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化也可用SDS破碎細胞，蛋白酶K降解蛋白后，苯酚抽提，再用RNase分解除去RNA而獲得純化的DNA。（一）DNA分離純化也可用SDS破碎細胞，蛋白酶K降解蛋白后45制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：①容器用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。然后經過高溫處理。DEPC能使蛋白質乙基化而破壞RNase活性；②加入強變性劑（如胍鹽：可使所有蛋白質變性）使RNase失活；③在RNA的反應體系內加入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：（二）RNA的分離46①用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。鹽酸胍、苯酚等去蛋白②用酸性胍鹽/苯酚/氯仿抽提：異硫氰酸胍是極強的蛋白質變性劑。后用苯酚和氯仿多次除凈蛋白質③用胍鹽/氯化銫將細胞抽提物進行密度梯度離心，蛋白質在最上面，DNA在中間，RNA沉在底部★mRNA的制備：oligo(dT)纖維素（瓊脂糖凝膠）親合層析法

制備RNA的方法：①用0.14mol/LNacl使DNP沉淀，上清中即為R47（三）核酸含量的測定2、定糖法RNA：核糖→糠醛→→綠色物質（670-680nm）DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個A～50μg/ml雙鏈DNA～40μg/mlRNA或單鏈DNA（三）核酸含量的測定2、定糖法苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1483、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當于10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成復合物在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光熒光強度與DNA含量成正比3、定磷法49細胞或組織中核酸含量測定方法生物組織酸溶性物質殘留物冷的稀酸抽提脂類物質殘留物熱酸法冷酸法堿法殘留物酸抽提液(RNA+DNA)熱酸提取殘留物殘留物酸抽提液(DNA)熱酸提取酸抽提液(RNA)冷酸提取酸抽提液(RNA)殘留物(DNA)有機溶劑抽提堿降解再酸化細胞或組織中核酸含量測定方法生物組織酸溶性物質殘留物冷的稀酸50純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260／OD280純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染（四）、核酸51二、核酸的沉降特性與超速離心

利用超離心技術，可以測定核酸的沉降常數和相對分子質量。密度梯度沉降平衡超離心法在核酸分子構象的研究中應用頗廣。DNA分析時，常用氯化銫密度梯度。主要應用于以下方面：核酸密度的測定測定DNA中的G-C含量溶液中核酸構象的研究用于核酸的制備二、核酸的沉降特性與超速離心利用超離心技術，可528MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：未知DNA的密度ρ0：為標準DNA的密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉軸的距離r0：已知DNA到轉軸的距離（一）核酸密度的測定8MCsCl，45000rpm，16h（一）核酸密度的測定53G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系，因此可用能用該方法計算DNA堿基成分，計算公式為：ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10需注意的是：含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其實際浮力密度會降低，低于理論值，不能用該公式計算。（二）測定DNA的G-C含量G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系，因此可用能用該方54RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構象RNA＞DNA（三）研究核酸的構象55（四）用于核酸的制備不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA與蛋白質區(qū)分開來，利用EB（溴化乙錠）與核酸結合，能在紫外燈下發(fā)出熒光的特性，將目的區(qū)帶收集。（四）用于核酸的制備不同構象的核酸（線形、環(huán)56是當前核酸研究中最常用的方法。有許多的優(yōu)點：簡單、快速、靈敏、成本低。常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳用于大片段DNA或RNA的分離，精度低，但分離范圍廣。是當前核酸研究中最常用的方法。有許多的優(yōu)點：簡單、快速、靈敏57電泳遷移率決定于：（1）核酸分子的大小（遷移率與相對分子質量對數成反比）（2）膠濃度（遷移率與膠濃度成反比，常用0.7～1%）（3）DNA的構象：超螺旋＞線狀分子＞開環(huán)狀分子（4）電壓（一般5V/cm,電壓與遷移率成正比)（5）堿基組成（影響不大）（6）溫度（4～30℃都可以，常室溫進行）

瓊脂糖凝膠電泳常用于DNA分析；分析RNA時需加入蛋白質變性劑甲醛。電泳完畢用溴化乙錠（0.5μg/mL）染色，用紫外光檢測電泳遷移率決定于：58第15章核酸的研究方法課件59★瓊脂糖電泳用于DNA分子量的測定在同一凝膠中加入已知相對分子質量的樣品（分子marker)，在電泳完成后，通過染色，照相，從照片上比較待測樣品的DNA片段與標準樣品的中的已知大小片段，可以推測待測未知DNA片段的分子大小?！锃傊请娪居糜贒NA分子量的測定在同一凝膠中加入已知相對分60用于小片段DNA的分析相對分子質量小于1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析時不會分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）用于小片段DNA的分析（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）61（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定英國Sanger1955確定牛胰島素結構，1958獲諾貝爾化學獎1975設計出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學獎合成一系列與待測DNA序列互補的DNA片段群。

（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定英國Sa62第15章核酸的研究方法課件63末端終止法——Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。末端終止法——Sanger64第15章核酸的研究方法課件65第15章核酸的研究方法課件66DNA序列分析儀：四色熒光基團標記的dNTPDNA序列分析儀：67（二）DNA的化學法測序：由Maxam和Gilbert所發(fā)明。其基本原理是用特異的化學試劑作用于DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應，可使末端標記的DNA分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜

（二）DNA的化學法測序：由Maxam和Gilbert所發(fā)明684組特異的反應如下：（1）G反應：用硫酸二甲酯DMS使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂（2）G+A反應：用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使鍵斷裂（3）T+C反應：用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基（4）C反應：當有鹽存在時，只有C與肼反應，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂4組特異的反應如下：69（三）RNA的測序RNA的測序方法有3個：（1）用酶特異切斷RNA鏈：胰RNaseA：嘧啶核苷酸鍵米曲霉RNaseT1：鳥苷酸核苷酸鍵黑粉菌RNaseU2：腺苷酸核苷酸鍵多頭黏菌RNasePhyI：A、G、U核苷酸鍵（2）用化學試劑裂解RNA（與DNA化學測序法類似）（3）逆轉錄成cDNA（三）RNA的測序701995年K.Mullis發(fā)明。基本步驟為：