甜瓜白粉病抗病基因的SSR標記

PAGE甜瓜白粉病抗病基因的SSR標記PAGE本科畢業(yè)論文題目甜瓜白粉病抗病基因的SSR標記學院農學院專業(yè)園藝畢業(yè)屆別姓名指導教師職稱研究員甘肅農業(yè)大學教務處制二〇〇九年五月目錄摘要 1關鍵詞 11前言 12材料與方法 12.1材料 12.1.1植物材料 12.1.2病原材料 22.1.3SSR引物及試劑 22.2方法 22.2.1DNA提取前期的植物材料準備 22.2.2基因組DNA的提取 22.2.3SSR引物多態(tài)性篩選 32.2.4非變性聚丙烯胺凝膠電泳檢測 32.2.5抗病池和感病池的構建 53結果與分析 53.1甜瓜基因組DNA的提取 53.2SSR引物在兩親本間的擴增 53.3SSR引物在兩池間的擴增 83.4多態(tài)性SSR引物CSAT425的F2群體檢測 94討論 104.1PCR體系各組分的影響 104.2關于BSA法 10參考文獻: 11英文摘要 12致謝 13PAGE13甜瓜白粉病抗病基因的SSR標記（甘肅農業(yè)大學農學院蘭州730070）摘要：本實驗以抗白粉病品種PMR5和感白粉病品種黃河蜜與其雜交后代F2群體為材料。通過分離群體分組分析法（BSA），利用F2群體的極抗株和極感株的DNA建立抗、感池，進行抗病基因的SSR標記篩選。經過反復的篩選，引物CSAT425在親本和F2代抗感基因池之間擴增出一條大小約為98bp的多態(tài)性片段。經F2代群體單株驗證后，該多態(tài)性條帶與PMR5抗白粉病基因連鎖，其標記與抗白粉病基因的重組率為13%。定名為CSAT42598，可以作為甜瓜抗白粉病輔助選擇的分子標記。關鍵詞：甜瓜；白粉??；抗病基因；SSR標記1前言甜瓜（Cucumismelo）是世界十大水果之一，在世界園藝業(yè)中占有重要的地位。甜瓜在中國栽培歷史悠久，中國甜瓜的面積和產量均居世界第一。西部地區(qū)甜瓜更是重要的經濟作物。甜瓜白粉病是甜瓜重要的病害之一，常常造成甜瓜產量的損失和品質的降低。解決病害最有效、最安全的方法就是培育抗病品種。而利用分子標記輔助抗病品種的選育將能極大的提高選擇效率和縮短育種進程。分子標記是以生物體的遺傳物質DNA的多態(tài)性為基礎的遺傳標記。目前，廣泛應用的分子標記技術主要有RAPD[1]、AFLP[2]、ISSR[3]、SSR[4]等。SSR微衛(wèi)星標記也稱簡單序列重復，其最大特點是等位位點豐富，因此SSR標記成為有價值的遺傳標記。本試驗以抗感病材料雜交的F2代為材料，采用分離群體分組分析法（BSA）和SSR標記法進行甜瓜白粉病抗病基因的標記，為分子標記輔助選育抗病品種奠定基礎。2材料與方法2.1材料2.1.1植物材料甜瓜材料親本為：甜瓜抗病品種PMR5、感病品種黃河蜜3號，以PMR5為母本，黃河蜜3號為父本雜交得F1，F(xiàn)1自交得F2。2008年4月初將雙親、F1和F2群體材料播種，5月份進行苗期白粉病菌接種鑒定。苗期接種試驗在甘肅農業(yè)大學農學院試驗基地塑料大棚內進行。2.1.2病原材料甜瓜白粉病菌采自皋蘭縣什川大棚的甜瓜植株上，活體保存，備用。2.1.3SSR引物及試劑本實驗所用化學試劑均為市售。選擇的200對SSR引物，由上海生物工程有限公司合成。PCR擴增反應試劑（10×PCRBuffer、Mg2+、dNTP、Taq酶）均購自天為時代蘭州百澳生物公司。2.2方法2.2.1DNA提取前期的植物材料準備將材料中種子采用同樣的方法種于大棚內，當植株長到四到五片真葉從各品種植株上分別取一片真葉用液氮速凍后置于-70℃溫度下保存。用摩擦接種法接種白粉病病原菌。當感病對照品種黃河蜜感病普遍率達100%時，即可調查試驗材料單株侵染型。本研究選用了中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所植保室的病情分級標準，將發(fā)病程度分為6個級別：0級，無病癥；1級，病斑面積占總葉面積的1/3，白粉模糊；2級，病斑面積占總葉面積的1/3-2/3，白粉明顯；3級，病斑面積占總葉面積的2/3以上，白粉厚，連片；4級，白粉濃厚，葉變黃，壞死；5級，壞死葉面積占總葉面積的2/3以上。并且調查時每個單株自下而上、由重到輕調查5片葉子，根據(jù)侵染型級別及各級侵染型數(shù)目確定抗、感類型的劃分標準。對F2抗、感病株進行統(tǒng)計?？共∮H本PMR5，感病親本黃河蜜3號，F(xiàn)１，F(xiàn)２等四個材料在甜瓜苗期取樣，于各單株上取3～4片新鮮葉片，并單株掛牌標記，取下的新鮮葉片裝入保鮮袋中，用冰盒帶回實驗室，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸干水分。用液氮速凍后-70℃冷凍保存，DNA提取前一天轉入-20℃冰箱。2.2.2基因組DNA的提取1)準備工作●將洗干凈的研缽、研杵預先放進冰箱冷凍室預冷，可減少液氮用量?！裉镩g采取的新鮮葉片放入裝有冰的冰盒中備用?！駥o水乙醇、異丙醇放入冰箱預冷?！裨?%CTAB(2%CTAB，100mmol/LTrispH8.0，20mmol/LEDTA，1%PVP，1.4mol/LNaCl)中加入β-巰基乙醇，使溶液終濃度達到2％（v/v）?！駥⒓尤毽?巰基乙醇的CTAB抽提液放在恒溫水浴鍋中65℃預熱。2)DNA的提取取新鮮葉片，放入預冷的研缽中加入液氮迅速研磨成細粉狀，并快速轉移到2ml滅菌的離心管中，立即加入750μL預熱的CTAB提取緩沖液，充分混勻后在65℃水浴中放置30～60min，其間不時的顛倒混搖數(shù)次。（注意：樣品的量不能太多，否則CTAB加入的量太少，細胞裂解不充分。）●加入等體積氯仿：異戊醇（24:1，v:v），輕緩顛倒離心管充分混勻；●在室溫下12000rpm離心10min；●取上清液加入等體積預冷的氯仿：異戊醇(24:l)，將離心管緩慢顛倒幾分鐘，使管內充分混勻。在4℃下，12000rpm離心10min，將上清小心轉移到新的2ml離心管中。（注意：吸取2/3的上清即可，不能吸取太多，防止將氯仿：異戊醇或沉淀吸入，降低DNA的純度。）●加入上清體積2/3預冷的異丙醇，緩慢混勻，顛倒10次。置于-20℃下沉淀2h，在4℃下，12000rpm離心10min；●棄上清。加入200μLTE溶液(稍多加)，溶解DNA；加2ul10mg/mlRNAse37℃，水浴30min；●加入等體積預冷的氯仿/異戊醇(24:l)輕輕混勻，靜置10min，在4℃下，12000rpm離心10min；●取上清加入2倍體積冷的無水乙醇。-20℃放置30min或更長時間，在4℃下12000rpm離心10min，倒掉上清液；●用70%的冷乙醇洗沉淀，4℃，12000rpm離心5~8min，倒掉上清液；●再用無水乙醇漂洗1次。4℃，12000rpm離心5~8min，倒掉上清液;●置于超凈工作臺上吹干，或用冷凍真空干燥機抽干；●加100μLddH2O或TE（PH8.0）緩沖液使沉淀溶解，-20℃保存。2.2.3SSR引物多態(tài)性篩選用所選取的200對微衛(wèi)星引物對抗病親本PMR5和感病親本黃河蜜進行掃描，篩選出在兩親本間具有多態(tài)性的引物。2.2.4非變性聚丙烯胺凝膠電泳檢測[7]1)膠板的制備●玻璃板的清洗：用溫水沾上洗滌靈將玻璃板反復擦洗干凈，然后用酒精擦洗、干燥。吸取15～16μL剝離硅烷于凹口玻璃板上，并用餐巾紙將其涂抹均勻，再用95％酒精稍微涂抹。操作過程中，防止兩塊玻璃板相互污染，徹底干燥后才進行玻璃板組裝；●電泳槽的組裝，水平儀檢測（灌膠口稍微高一點）；●膠的配制：50ml6％聚丙烯酰胺膠+150～200μL10%的過硫酸銨（AmmoniumPersulphate）+40～50μLTEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)，迅速輕輕搖勻，小心不要引入氣泡。加入APS和TEMED后要迅速灌膠；●灌膠：把膠沿灌膠口輕輕灌進，同時輕輕敲打，防止出現(xiàn)氣泡。待膠流到底部，在灌膠口輕輕插入梳子，梳齒朝外，讓其聚合至少2小時（若讓膠過夜，在膠的兩口鋪上濕濾紙、保鮮膜以防膠干）。2)電泳●25μLPCR擴增產物中加入5μL甲酰胺上樣緩沖液，95℃變性8min，然后立即冰??；●將1800ml1×TBE緩沖液加入到電泳儀的正極槽和負極槽；●裝上膠板，取掉梳子，清除氣泡；●恒功率50W預電泳20min；●清除氣泡，加入5μLPCR擴增產物，40W恒功率電泳，電泳時間可視SSR擴增產物的分子量而略微加以調整；●電泳結束后，小心分開兩塊玻璃板。3)銀染銀染方法參照Sanguinetii等的方法，部分步驟略做改進。銀染全部過程在搖床上進行?！窆潭ㄅc脫色：取合適的塑料盒，倒入10％乙醇（50ml）+0.5％冰醋酸溶（2.5ml）定容至500ml在搖床上輕輕搖動固定5～10min，直至指示劑的顏色褪去為止。●水洗：用蒸餾水水洗10～15min?！胥y染：把膠放入染色液1gAgNO3+0.5ml10%乙醇（50ml）+0.5％冰醋酸液（2.5ml）定容至500mlddH2O，在搖床上輕輕搖動染色6min；●水洗：蒸餾水迅速水洗5s?！耧@影：將膠放入顯影液（6gNaOH+200ml蒸餾水+1ml甲醛）中輕輕平行搖動，直至條帶出現(xiàn)，清晰為止?！駴_洗：用ddH2O沖洗2次?！駥嶒灲Y果記錄分析：膠板可永久保存，或進行拍照。2.2.5抗病池和感病池的構建[8]根據(jù)Michelmoretal介紹的集群分析分離法，簡稱BSA(BulkSegregateAnallysis)法，從F2群體中選取若干株極抗病株，將其單株DNA等量混合，構建成抗病基因池；再取若干株極感病株，將其單株DNA等量混合，建立感病基因池。用在兩個親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物掃描抗池和感池，尋找在抗池和感池間表現(xiàn)多態(tài)性的引物。3結果與分析3.1甜瓜基因組DNA的提取采用CTAB法[9]-[11]提取甜瓜材料基因組DNA，用紫外吸收法測定DNA樣品純度后，計算基因組DNA濃度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測稀釋結果，檢測結果表明供試材料的基因組DNA主帶清晰而集中，說明DNA提取完整、無降解現(xiàn)象，適合于SSR分析。甜瓜基因組部分DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1。圖1.供試甜瓜材料的基因組DNAFig圖1.供試甜瓜材料的基因組DNAFig1.GenomicDNAextractedfrommelonmaterialstested3.2SSR引物在兩親本間的擴增以兩親本（PMR5、黃河蜜）為材料對200條SSR引物進行PCR擴增，篩選在兩親PsPRPsPRPsPRPsPRPsPRPsPRMPsPRPsPRPsPRPsPR圖2圖2部分SSR引物在兩親本間的篩選Fig2ScreeningofsomeSSRprimersbetweentwoparentsM：Maker；PR：抗病親本；PS：感病親本M:Maker；PR：Parentofresistance；PS：Parentofsusceptible; 本間具有多態(tài)性的引物(圖2)。結果表明其中有193對引物在兩親本間均能同時有效擴增，其中有46對引物在親本間表現(xiàn)多態(tài)性表1。表146對在親本間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物Table146SSRprimersintheperformanceofpolymorphismbetweenparentPrimer名稱序列(5'to3'/3'to5')Tm(℃)CMGA15CGGCAAGACGATTGGCAGCATCACCGTAGCGAAGCACC55CMCT44TCAACTGTCCATTTCTCGCTGCCGTAAAGACGAAAACCCTTC58CMGA104TTACTGGGTTTTGCCGATTTAATTCCGTATTCAACTCTCC54CMCTT144CAAAAGGTTTCGATTGGTGGGAAATGGTGGGGGTTGAATAGG58CMGA172CAATCGCAGATACTTCCACGTGCTTGTCCCAACGGTGTCAT59CMTC123CGGATTGTACTTATTGCCAAGCATGTGCATGTGTGCATGTAC57CMTC158CCCCCATATTCATCAAAACTTCAGCTCACTTTTCCATTCA54CMTA170aTTAAATCCCAAAGACATGGCGAGACGAAGGACGGTTAGCTTT57CMGA165AGTTCGGTTTAACTACCCACGTTCAACTACAGCAAGGTCAGC58CSCT335CCTTCACTTCCATCTTCATCCGGTCCTTCATTTCATAGAC56CMAT35GTGGGTCATCATTATTGTTAGCTTTTAGCCTATTAAGTTGC52CMBR7AAAATGAATGGGAGTGCGTGGCCTTCCTTTTCACCATCAA56CMBR22CCAAAACGACCAAATGTTCCATACAGACACGCCTTCCACC58CMBR24TGGGGTTGTCAATACAGCAAAAAATGAATGGGAGTGTGTGG56CMBR27AAACAAACATGGAAATAGCTTTCATAGTTGGGTGGGCTAAAGGA56CMBR39GGCAAAGAAGAAGGAAGAGTGAAGAGATGCTCCCTACACTGC59CMBR43AGAGATGCTCCCTACACTGCTCAAGCAAACCCTAATCGGT54CSAT425TAGGGCAGGTATTATTTCAGACGGACTGATTTAGTATAGGC53SSR25ATCATTGGATGTGGGATTCTCACAGATGGATGAAACCTTAGG56SSR749AATCCCAAATCACACCCAAACCAGCTTTTGATGCCTCTCT56CMCTN4AAAACAAAAGCTCTCCACGACTTTCCTTTATTATGCCTACG55CMTCN6GCATTGCTCGATCAGTTTTACACTCCGTCAAGATCCCAAAA57CMGAN12TTTTTGTCGTTATATGAGGGGTTGCATAATGCTAATTTGG52CMTCN18ACCAATCCATCACTCTCACTGAAAGAATGGGGGAAAAGAG56CMGAN24TAACTATGATGAAGAGTTTGCCAAACTATAATCACACTA56CMTCN30GGAGGGAAAGGAAAGAGAGAGGCAAGAAGATGGCAAAGAT56CMCTN35CCAATAATGTAATCGTCTTGGGTTCCAAACTTTCTACCAATCA54CMCTN38TAAAACACTCTCGTGACTCCGATCTGAGGTTGAAGCAAAG55CMAGN45CCCACAAGAGAGAGAGAGAGGTGTGACAGGTAGATTGTTGG57CMTCN56CTTTTCTCTTCTTCTATTCTCATCCAAAAGGAATCGGAAAG57CMGAN80ATATTGATTGCTGGGAAAGGCTTTTTTGGCTTTATTGGGTC56CMGAN92GAGAGAGAGAGAGAGATGGGTTGGGTACTCCGAGTTA55CMCT126CTTTAGGTGTGAGATTGGTGGGCACATCATTGGAGTAACTCG58CMTC51ATTGGGGTTTCTTTGAGGTGACCATGTCTAAAAACTCATGTGG56MC219TTCAGGGATTGGACCCTCTATCCAAATCTCTGGCAATCGAT57ⅢGCTAACGTATGCGTAGTACGTAGATCGGGCTATACCGGAATTCGGC62ⅦCCCTTTGAGATTGAGGATGAAATGCGAACCTTTTCAAG53CMTCN66CTCCGATCAATTTTACATCTGAATAAACTTGGTGTCCAAC55CMATN38TAAAACACTCTCGTGACTCCGATCTGAGGTTGAAGCAAAG55CMTCN41CCCCAAGATTCGTATTAATCTGGTAGTAGAGATGATATAC57CMTCN50TCTACTTCCATGAATCCATCTAGAATGGTTAGGAAACCCT57CMAGN73ATCCAACTCGACCAAGAAACCAGCTCTACAACAACATCTC54CMAGN79CTTCACTAAAACTACAAGAGTTCCAACTTATTCATCCCAC55CMTA170bATTGCCCAACTAAACTAAACCCACAACACAATATCATCCTTG56CMTCN14TATATTGGCTTTGGCTCTCGGATTCGTTATCTCGACCAAC57CMAGN75TGGGTTTTCTTCTACTACTGTGCTTTTACTCTCATTCAAC563.3SSR引物在兩池間的擴增選取極抗和極感單株的DNA分別等量混合，構成抗病池和感病池，采用SSR技術，對在親本間有多態(tài)性的46對引物進行進一步篩選，其中引物CSAT425在抗感池間穩(wěn)定擴增出一條約98bp的差異條帶，初步表明引物CSAT425與目標基因連鎖（圖3）。BBsBRBsBRMBsBR98bp98bp圖3抗、感病池間不同SSR引物的篩選Fig3ScreeningofsomedifferentsSSRprimerswithresistantandsusceptiblegroupsM：Maker

；Bs：感病池；BR：抗病池M：Maker；Bs：susceptiblegroup；BR：resistantgroup3.4多態(tài)性SSR引物CSAT425的F2群體檢測PPRPs123M4567891011121314151617181920圖4引物CSAT425在部分F2單株中的驗證Fig4.ThepartsofF2plantswithSSRmakerCSAT425totestsM：Maker；PR抗病親本；Ps：感病親本；1-20：部分F2代單株。.M：Maker；PR：Parentofresistance；PS：Parentofsusceptible；1~20：TheF2plants．用引物CSAT425對F2群體單株進行掃描。兩親本的特異帶分別記做A型帶（抗病親本的帶型一致），B型帶（與感病親本一致的帶型）?？共〕財U增出與抗病親本相一致的特異帶，記做A型帶。感病池擴增出的條帶和感病親本的特異帶大小相同，記做B型帶。提取180株F2群體單株DNA，用抗、感池篩選獲得的與目標基因連鎖的引物CSAT425掃描F2群體，進行擴增后，統(tǒng)計抗病親本帶型、感病親本帶型。在感病植株中有9株單株出現(xiàn)了CSAT42598，抗病植株中有15株的CSAT42598消失，重組率為13%。圖4為在甜瓜抗、感池間篩選出的多態(tài)性引物CSAT425在F2代分離群體的檢測。圖中所示的20個序號中，1～20為F2代分離群體，其中17、18號的表型為抗病株，但標記的特異條帶消失，其余標記結果與表型相符。4討論4.1PCR體系各組分的影響SSR標記包括兩個步驟：PCR反應和電泳檢測。針對不同作物建立相適應的PCR反應體系，是取得試驗成功的關鍵[12]。影響SSR-PCR穩(wěn)定性的因素有內部和外部因素。內部因素即PCR反應體系中的各組分的影響，其中包括模板DNA的純度和濃度、引物的質量和特異性、Taq聚合酶的用量、MgCl2、dNTP的濃度。外部因素主要包括PCR儀的型號、PCR反應程序的設定、電泳條件等。為了得到高效的擴增產物，在進行SSR擴增前，DNA擴增的條件首先需要優(yōu)化，最終實現(xiàn)擴增可重復的SSR圖譜。在本試驗中，我們在前人研究的基礎上，分別對SSR反應體系（模板濃度、10×buffer、Tag聚合酶濃度、dNTP濃度、引物濃度）進行了摸索研究，得到一套適合本實驗要求的SSR反應條件：反應體系（25.0μl）中含有10×TaqBuffer2.5μL，2.5mmol/LdNTPs2.0μL，MgCl2(25mmol/L)2.0μL，2.5U/μlTaq酶0.4μL，SSR上、下游引物（5pmol/μL）各2.0μL，其中發(fā)現(xiàn)，模板DNA的量在50～200ng之間都能擴增出適于分析的有效條帶，說明基因組模板濃度對擴增結果并沒有明顯影響，這表明SSR技術對DNA質量要求不高。4.2關于BSA法BSA（集團分離分析法，又稱分離體分組混合分析法或混合分組分析法，BulkSegregateAnallysis）分析法首次由Michelmore等提出并成功地在萵苣中篩選出與目的基因相連鎖的標記。該方法首先從一對具有目標基因的表型差異的親本所產生的任何一種分離群體中，根據(jù)目標基因的表型分別選取一定數(shù)量的植株，構成2個亞群或集團。將每群的DNA等量混合，形成兩個相對性狀的“基因池”（genepool），然后用合適的分子標記對兩個基因池進行分析，在兩群間表現(xiàn)多態(tài)性的分子標記遺傳上與目標性狀基因座位相連鎖。在獲得了與目標基因相連鎖的分子標記以后，可以利用某一作圖群體進行分析以便進一步檢測所得分子標記與目標性狀基因的連鎖程度，以及其在某已知分子圖譜中或染色體上的位置，這樣才能完成真正意義上的對基因的標記定位。由于建池時使用了特定的分離群體，并且在分組時僅對目標性狀進行選擇，這樣可以保證其他性狀的遺傳背景基本相同，兩個基因池之間理論上就應主要在目標基因區(qū)段存在差異，因此兩基因池又被稱為近等基因池，這就排除了遺傳背景的影響，使研究結果更為準確可靠[13]。在實驗中運用BSA法需要注意以下一些問題：在親本的選擇上要有科學的性狀選擇標準，并對親本進行性狀鑒定，利用兩親本雜交后分離的F2代構建基因池。本實驗中選擇的兩親本（PMR5，黃河蜜）分別為抗病和感病品種，在目標性狀上存在較大差異，可用于BSA法進行分子標記。實驗材料由PMR5×黃河蜜雜交的F1代中的一株單株繁衍而來的F2群體。在選擇建池單株時要根據(jù)調查記錄的材料來選擇，要確定選擇那些對白粉病病原菌有極端表現(xiàn)的植株。兩池內各株的DNA要等量混合，兩親本的遺傳背景比較一致時，建池植株數(shù)可少至5株，如遺傳背景差距較大，可增加株數(shù)。在本實驗中，我們選擇了整個植株都覆蓋白粉的作為極端感病植株。以極端感病株周圍植株的葉片、葉柄、莖以及下胚軸都沒有白粉的作為極端抗病植株，利用紫外吸收法計算基因組DNA濃度，根據(jù)計算值將基因組DNA分別稀釋成等濃度，從而保證兩池內的各株DNA能夠等量混合。才能避免將個別單株之間的差異作為所要篩選的目的標記而產生假陽性。本試驗中篩選出的CSAT42598標記與抗病基因的交換率為13%，其遺傳距離相對有些遠，但在沒有找到更好的標記之前，該標記可以用于相關材料抗病基因的輔助選擇。其與抗病基因連鎖更緊密的標記有待于今后進一步的試驗研究確定。參考文獻:[1]李麗，鄭曉鷹，KlockeE．利用RAPD分子標記對番茄雜交種純度的鑒定研究．廣西植物，2003，23（2）：149~154[2]田雷，曹鳴慶，王輝，郭晶心，周乃元，孫江，賈希海．AFLP標記技術在甘藍種子真實性及品種純度中的應用．生物技術通報，2001，28（3）：38~40[3]易克，徐向利，盧向陽．利用SSR和ISSR標記技術構建西瓜分子遺傳圖譜．湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2003，29(4)：333~347[4]李曉輝，李新海，李文華，王振華，馬鳳鳴，袁力行，張世煌．SSR標記技術在玉米雜交種種子純度測定中的應用．作物學報，2003，29（1）：63~68[5]DellaportaSL,WoodJ,HicksJB．AplantDNAminipreparation：VersionⅡ．Plant,1983,1：19~21[6]DudlerR．Thesingle-copyactingeneofPhytophthoramegaspermaencodesaproteinconsiderablydivergedfromanyotherknownactin．Plant,1990,14：415~422[7]蘭海燕，李立會．蛋白質凝膠電泳技術在作物品種鑒定中的應用．中國農業(yè)科學，2002，35（8）：916~920[8]MichelmoreRW，ParanandI，KessaliRV．Identificationofmarkerslinkedtodiseaseresistancegenebybulkedsegregantanalysis：arapidmethodtodetectmarkersinspecificgenomicregionsusingsegregatingpopulations[J]．ProcNatlAcadSci1991，88：9829~9832．[9]陸璐，趙長增，陶興林．從甜瓜子葉中提取總DNA．