酶聯(lián)免疫吸附試驗（胡榮）

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）主講：胡榮一、基本原理將已知抗體（抗原）吸附在固相載體表面以后，抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌的方法使固相上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，最后加入底物，根據(jù)酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度，對標(biāo)本中的抗原（抗體）進(jìn)行定性或定量。

基本過程：包被→加樣→洗滌→顯色ELISA

間接法雙抗原夾心法競爭法

捕獲法檢測Ag方法檢測Ab方法

雙抗體夾心法

雙位點(diǎn)一步法

競爭法二、技術(shù)類型ELISA學(xué)習(xí)總體思路（三步曲）名稱中找技術(shù)要點(diǎn)作原理模式圖理清思路“提問”提出注意點(diǎn)ELISA1、雙抗體夾心法（最常用）1）、包被抗體、洗滌；2）、加待測標(biāo)本，溫育、洗滌；3）、加酶標(biāo)抗體，溫育、洗滌；4）、加底物顯色。（載體-Ab-Ag-Ab*E）注意點(diǎn)：RF可引起假陽性結(jié)果。（一）檢測抗原的技術(shù)類型ELISA

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測抗原1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物1、已知抗體包2、加待檢物無抗3、加酶標(biāo)抗體EYYYYEYEYYYYEYYYYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYY雙抗體夾心法檢測抗原+-洗滌洗滌洗滌洗滌2、雙位點(diǎn)一步法

將固相抗體和酶標(biāo)抗體換為針對抗原分子上兩個不同表位的兩種McAb。測定時將含待測抗原標(biāo)本與酶標(biāo)抗體同時加入進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，兩種抗體互不干擾，經(jīng)過一次溫育和洗滌后，加入底物進(jìn)行顯色測定。

（載體-Ab-Ag-Ab'*E）

注意點(diǎn)：避免“鉤狀效應(yīng)”導(dǎo)致假陰性。

ELISA雙位點(diǎn)一步法檢測抗原

EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體3、競爭法

1）、包被抗體（目標(biāo)）；

2）、加待測抗原（甲）和酶標(biāo)抗原

（乙），溫育、洗滌；

3）、加底物顯色。

（載體-Ab-Ag/Ag*E）注意點(diǎn)：底物顯色深淺與待檢標(biāo)本中抗原含量

成反比。ELISA陽性陰性YYY2、加待測物抗原及酶標(biāo)抗原與抗體競爭結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物抗原及酶標(biāo)抗原競爭與抗體結(jié)合競爭法檢測抗原YYYEYYYEYYYYYYEEEYYYEEE

1、間接法（最常用）

1）、包被抗原；

2）、加適當(dāng)稀釋的待測標(biāo)本，溫育、洗滌；

3）、加酶標(biāo)二抗，溫育、洗滌；

4）、加底物顯色。

（載體-Ag-Ab1-Ab2*E）注意點(diǎn)：可用一種酶標(biāo)二抗檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體，只要求一抗是同類即可。（二）檢測抗體的技術(shù)類型ELISA

間接法檢測抗體固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE2、雙抗原夾心法

1）、包被抗原；

2）、加待測標(biāo)本，溫育、洗滌；3）、加酶標(biāo)抗原，溫育、洗滌；4）、加底物顯色。

（載體-Ag-Ab-Ag*E）注意點(diǎn)：若采用一步法因機(jī)體產(chǎn)生抗體IgG的效價有限，一般不會出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。ELISA酶標(biāo)抗原固相抗原待測抗體底物雙抗原夾心法檢測抗體模式圖3、競爭法A：競爭法檢測HBcAb

1）、包被HBcAg（目標(biāo)）；

2）、加待測標(biāo)本（甲）和酶標(biāo)抗體

（乙），溫育、洗滌；

3）、加底物顯色。

（載體-Ag-Ab/Ab*E）ELISA競爭點(diǎn)競爭法檢測HBcAb示意圖固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEEB：競爭法檢測HBeAb

1）、包被HBeAb（甲）；

2）、加待測標(biāo)本（乙）和HBeAg（目標(biāo)），

溫育、洗滌；

3）、加酶標(biāo)HBeAb（丙），溫育、洗滌；4）、加底物顯色。

（載體-Ab-Ag-Ab/Ab*E）ELISA固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競爭法檢測HBeAb競爭點(diǎn)

注意點(diǎn)：待測標(biāo)本中HBeAb量越高，則與HBeAg結(jié)合越多，固相HBeAb結(jié)合的HBeAg越少，加入酶標(biāo)抗體后顯色越淺。因此顯色深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。

ELISA4、捕獲法

1）、包被抗人IgM抗體；

2）、加入待測稀釋血清，捕獲血清中所有的

IgM，溫育、洗滌；

3）、加入特異性Ag，溫育、洗滌；

4）、加入針對特異性Ag的酶標(biāo)抗體，溫育、洗滌；

5）、顯色，定性、定量特異性IgM。（載體-抗人IgM-IgM-Ag（特異性）-Ab*E）

ELISAEYEYEYEYEYYYYYYY1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待測物，特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法檢測抗體IgM+-注意點(diǎn)：1、急性感染的早期診斷；2、最常用的IgM抗體檢測方法；3、RF（IgM類）可致假陽性結(jié)果；4、適當(dāng)稀釋以減少標(biāo)本中非特異性IgM的干擾。ELISAELISA

（一）應(yīng)用1、病原體及其抗體檢測廣泛用于傳染性疾?。ú《?、細(xì)菌、寄生蟲感染）的檢測。2、蛋白質(zhì)測定AFP、CEA等。3、非肽類激素測定T3、T4、TSH等。4、藥物和毒品測定地高辛等。

三、ELISA的應(yīng)用和注意事項ELISA（二）注意事項1、加樣

定性：滴加液體時每滴液體體積基本相同。

定量：加樣量力求準(zhǔn)確：加在孔底，避免氣泡和濺出。2、溫育

時間：按說明書要求。

溫育容器：水浴箱（內(nèi)置濕盒）、恒溫箱。

注意點(diǎn)：勿疊放，避免“邊緣效應(yīng)”。ELISA3、洗滌

目的：洗掉非特異性吸附。方法：手工洗板；洗板機(jī)洗板（多洗一次）。4、顯色時間：按試劑盒要求。5、比色波長選擇：根據(jù)底物不同選擇不同的波長。（TMB：450nm）方法：單波長比色、雙波長比色（最常用）。ELISA單波長比色：測定顯色液在敏