生物化學復習-蛋白質(zhì)3-5-1-7

第六節(jié)、蛋白質(zhì)分子結構與功能的關系蛋白質(zhì)分子具有多樣的生物學功能，需要一定的化學結構，還需要一定的空間構象。一、蛋白質(zhì)一級結構與功能的關系（一）同源蛋白質(zhì)一級結構的種屬差異與生物進化

蛋白質(zhì)一級結構的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質(zhì)的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質(zhì)結構上的差異，可以斷定它們在親緣關系上的遠近。同源蛋白質(zhì)：在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)。如血紅蛋白在不同的脊椎動物中都具有輸送氧氣的功能，細胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分

。

同源蛋白質(zhì)的特點：

A.不同種屬來源的同源蛋白質(zhì)具有相同長度或接近相同長度的多肽鏈。B.順序同源現(xiàn)象：同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性，這種相似性稱序列同源性，或順序同源現(xiàn)象。C.不變殘基和可變殘基：同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。

通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關系和進化，親源關系越遠，同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序差異就越大

存在：細胞線粒體－－電子傳遞蛋白組成：單鏈蛋白質(zhì)－－104個氨基酸，分子量12.5x103

1分子血紅素輔基25種生物中，細胞色素C的不變殘基35個。60種生物中，細胞色素C的不變殘基27個。親源關系越近的，其細胞色素C的差異越小。親源關系越遠的，其細胞色素C的差異越大。

1.細胞色素c物種的親緣關系越近，細胞色素c的一級結構越相似，據(jù)此可繪制系統(tǒng)進化樹，進行系統(tǒng)進化分析2.胰島素

不同生物的胰島素AA序列中，有24個氨基酸殘基位置始終不變，A,B鏈上6個Cys不變（重要性），其余18個氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結構起重要作用。其它氨基酸對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結構作用不大，但對免疫反應起作用，豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。（二）蛋白質(zhì)一級結構的個體差異—分子病

——基因突變引起某個功能蛋白的某個（些）氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導致整個分子的三維結構發(fā)生改變，致使其功能部分或全部喪失。鐮狀細胞貧血（sick-cellanemia）－－是最早被認識的一種分子病。它是由于基因突變導致血紅蛋白分子中氨基酸殘基被更換所造成的。β-鏈12345678Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…從患者紅細胞中鑒定出特異的鐮刀型或月牙型細胞。正常紅細胞鐮刀狀紅細胞（三）一級結構的部分切除與蛋白質(zhì)的激活

一些蛋白質(zhì)、酶、多肽激素在剛合成時是以無活性的前體形式存在，只有切除部分多肽后才呈現(xiàn)生物活性，如血液凝固系統(tǒng)的血纖維蛋白原和凝血酶原，消化系統(tǒng)的蛋白酶原、激素前體等。胰島素原的激活胰島素在胰島的β細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成，稱前胰島素原，含信號肽。前胰島素原在信號肽的引導下，進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，進入后，信號肽被信號肽酶切除，生成胰島素原，被運至高爾基體貯存。并在特異的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰島素。二、蛋白質(zhì)構象與功能的關系別（變）構現(xiàn)象：蛋白質(zhì)與配體結合改變蛋白質(zhì)的構象，進而改變蛋白質(zhì)生物學活性的現(xiàn)象。別構蛋白多是寡聚蛋白。因別構而產(chǎn)生的效應稱別構效應。在蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用中，能被它可逆結合的其他分子稱為配體。(一）肌紅蛋白的結構與功能1.肌紅蛋白的三級結構由一條多肽鏈和一個輔基血紅素構成，Mr為16.6KD，153個氨基酸殘基。KendrewJ及其同事于1963年完成肌紅蛋白的X-晶體學分析，最終分辨率為0.14nm2.輔基血紅素肌紅蛋白-血紅蛋白家族中鐵是由稱為原卟啉Ⅸ（protoporphyrinⅨ）的有機分子固定的。原卟啉Ⅸ由4個吡咯環(huán)原卟啉Ⅸ只有結合亞鐵態(tài)鐵才能結合氧3.O2與肌紅蛋白的結合氧合肌紅蛋白中血紅素鐵離子的6個配體4個是卟啉環(huán)中央的4個N原子，第5個是環(huán)面上方的His93（F8），第6個是下方的O2肌紅蛋白在進化中形成的多肽微環(huán)境至少有三個作用：固定血紅素基；保護血紅素鐵免遭氧化；為O2分子提供一個合適的結合部位4.O2的結合改變肌紅蛋白的構象鐵原子的位置與卟啉環(huán)平面的關系發(fā)生關鍵性改變?nèi)パ跫〖t蛋白中Fe（II）離子有5個配位體，位于離卟啉環(huán)平面上方（HisF8一側(cè)）0.055nm處。與O2結合時，F(xiàn)e（II）離子離卟啉環(huán)平面只有0.026nm.是血紅蛋白具有別構性質(zhì)的基本原因His64(E7)MbO2?Mb+O2K={[Mb][O2]}/[MbO2](1)Y=[MbO2]/{[Mb]+[MbO2]}(2)Y=[O2]/{[O2]+K}將（1）改寫為：[MbO2]={[Mb][O2]}/K并代入（2）得：

5.肌紅蛋白結合氧的定量分析(氧結合曲線)

當Y=1時，所有肌紅蛋白的氧合位置均被占據(jù)，即肌紅蛋白被氧飽和,K=0Y=0.5時，肌紅蛋白的一半被飽和，PO2=K，解離常數(shù)K稱為P50，P(O2)=K=P50或P0.5P50定義為肌紅蛋白一半被氧飽和時的氧分壓肌紅蛋白的氧合曲線呈雙曲線型，表明對O2的親和力較大，P50為2torr，適于儲氧（線粒體O2：0～10torr；靜脈血15torr或更高）。肌紅蛋白也利于胞內(nèi)的O2從內(nèi)表面向線粒體的轉(zhuǎn)運(內(nèi)表面10torr,80%飽和,線粒體1torr,25%飽和)Log[Y/(1-Y)]=logp(O2)?logKY=[O2]/{[O2]+K}=p(O2)/{p(O2)+K}YK=p(O2)?Yp(O2)=p(O2)(1?Y)Y/(1?Y)=p(O2)/K二、血紅蛋白的結構與功能在從肺部經(jīng)心臟到達外周組織的動脈血中Hb約為96％氧飽和度。在回到心臟的靜脈血中Hb僅為64％氧飽和度。因此每100ml血經(jīng)過組織約釋放Hb攜帶的1/3氧或相當于大氣壓和體溫下6.5ml氧氣血紅蛋白的結構、氧合過程中的構象變化、氧結合曲線和別構效應（協(xié)同性）1.血紅蛋白的結構

(1)．血紅蛋白的亞基組成血紅蛋白的構象（三維結構）(2)Hb的亞基與肌紅蛋白相似MbHbαHbβ2.氧結合引起血紅蛋白的構象變化兩個αβ二聚體的偏心樞軸旋移15°并平移0.08nm去氧血紅蛋白氧合血紅蛋白血紅素鐵的微小移動導致血紅蛋白構象轉(zhuǎn)變

存在空間效應和電子效應

Fe(II）由高自旋變?yōu)榈妥孕鼈?cè)His（F8）與Fe原子一起被拉動，F(xiàn)e-N鍵變成垂直于血紅素平面圖6-13去氧血紅蛋白中的各亞基間的鹽橋共8個鹽橋，氧合時伴鹽橋斷裂3.血紅蛋白的協(xié)同性氧結合（Hb氧結合曲線）圖6-14Hb和Mb氧合曲線的比較P

(O2)/torr氧飽和分數(shù)（Y）P50=26torr肺泡中P(O2)工作肌肉毛細血管中P(O2)Hb氧合曲線的比較由Y對P

(O2)作圖Y=P4(O2)P4(O2)+KP(O2)/torrY完全協(xié)同，n=4實驗觀察到亞基間結合氧時無相互作用血紅蛋白的Hill圖由此方程導出Y=P4(O2)P4(O2)+KYPn(O2)K=1–Y兩邊取對數(shù)，得log(Y/(1-Y))=nlogP(O2)-logK對logP(O2))Y1–Ylog(作圖Hill系數(shù)是協(xié)同性程度的一種量度

n=1表示配體結合是非協(xié)同性的;n>1表示配體結合是正協(xié)同性的;n<1表示配體結合是負協(xié)同性的。50%飽和度時,logK=n(logP50)或K=(P50)n血紅蛋白氧合協(xié)同性使它更有效的起著運輸氧氣的作用ΔY是血紅蛋白運輸氧效率的指標

Hb,ΔY=0.72;Mb,ΔY<0.1。協(xié)同效應增加血紅蛋白在肌肉中的卸氧效率.P

(O2)/torr氧飽和分數(shù)（Y）P50=26torr肺泡中P(O2)工作肌肉毛細血管中P(O2)Y=0.97Y=0.254.H+、CO2和BPG對血紅蛋白結合氧的影響H+、CO2和BPG在血紅蛋白上都有各自的結合部位，這種在空間上相隔部位間的相互作用——一種別構效應(1)、H+和CO2促進O2的釋放（Bohr效應）碳酸酐酶在紅細胞中特別豐富HbO2+H++CO2

←→HbH+CO2+O2

H+促進氧從血紅蛋白釋放圖6-17在不同pH下Mb和Hb的氧飽和分數(shù)曲線氧飽和分數(shù)（Y）組織中血液中實驗中P(O2)/torrCO2促進氧從血紅蛋白的釋放反應是可逆的，產(chǎn)生的H+貢獻于Bohr效應。氨基甲酸也可形成額外的鹽橋，有助于穩(wěn)定T態(tài)，促進氧的釋放(2)、BPG降低Hb對O2的親合力正常人的紅細胞約含有4.5mmol/LBPG，約與血紅蛋白等摩爾數(shù)。Hb四聚體分子中只有一個BPG結合部位。位于四個亞基締合形成的中央空穴內(nèi)。而氧合血紅蛋白（R態(tài)）中，中央空穴變得太小，容納不了BPG，因為O2的結合引起構象變化，擾亂了BPG的結合部位?？杀硎救缦拢築PG降低血紅蛋白對氧的親和力BPG與每個b鏈的Lysb82,Hisb2,Hisb143,N-末端Valb1等殘基的正電荷靜電作用圖6-19BPG對Hb氧合曲線的影響P(O2)/torr氧飽和分數(shù)（Y）組織中肺中（4500m）肺中(海平面）BPG進一步提高了血紅蛋白的輸氧效率。在肺部，PO2超過100torr，血紅蛋白幾乎全被O2飽和,BPG是否存在與氧和關系不大。在組織中，PO2低（<30torr)，BPG能降低血紅蛋白的氧親和力，加大血紅蛋白的卸氧量。（1）高山適應和肺氣腫的生理補償變化；BPG升高。（2）血庫儲血時加入肌苷可防止BPG的降解。

氧的S形曲線結合，Bohr效應以及BPG效應物的調(diào)節(jié)使得血紅蛋白的輸氧能力達到最高效率(協(xié)同效應、波耳效應、別構效應使血紅蛋白的輸氧能力達到最高效率)血紅蛋白使體內(nèi)的pH維持在一個較穩(wěn)定的水平血紅蛋白的別構效應充分反映了它的生物學適應性，結構與功能的高度統(tǒng)一性。1.胎兒血紅蛋白（HbF)在相當于成人血紅蛋白(HbA)b鏈143殘基位置含有Ser，而成年人b鏈的這個位置是具有陽離子的His殘基。殘基143面向b亞基之間的中央空隙。（1）為什么2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG)同脫氧HbA的結合比同脫氧HbF更緊？（2）HbF對2,3-二磷酸甘油酸的低親和力如何影響到HbF對氧的親和力？（3）HbF的P50是18托（Torr),HbA的P50是26托（Torr)，基于這兩個數(shù)值如何解釋氧從母親血液有效轉(zhuǎn)運到胎兒？γ鏈的143位為絲氨酸，而β鏈的143位為組氨酸

解析與要點：（1）2,3-二磷酸甘油酸的陰離子基團處在脫氧血紅蛋白兩條b鏈的Lysb82、Hisb143、Hisb2和N-末端Valb1氨基的陽離子形成氫鍵和鹽鍵的距離范圍內(nèi)，它可與中心空隙帶正電荷的側(cè)鏈結合，而脫氧HbFb鏈143殘基位置含有Ser，缺少帶正電荷的側(cè)鏈，減低了對2,3-二磷酸甘油酸的親和力（2）2,3-二磷酸甘油酸穩(wěn)定脫氧血紅蛋白的構象，HbF與2,3-二磷酸甘油酸的結合力低，因而增加了對氧的親和力。（3）在20~40torr氧分壓下，HbF對氧的親和力大于HbA允許氧由母親血向胎兒有效轉(zhuǎn)移。2.在體外，用下列方法處理對血紅蛋白與氧的親和力有什么影響？(1)pH值從7.0增加到7.4(2)CO2分壓從1000Pa增加到4000Pa(3)O2分壓從6000Pa下降到2000Pa(4)2,3-二磷酸甘油酸的濃度從8×10-4mol/L下降到2×10-4mol/L(5)

a2b2解聚成單個亞基解答：(1)pH值增加，Hb與氧的親和力增加(2)CO2分壓增加，Hb與氧的親和力降低(3)O2分壓下降，Hb與氧的親和力降低(4)2,3-DPG濃度下降，Hb與氧的親和力增加(5)a2b2解聚成單個亞基，Hb與氧的親和力增加三、血紅蛋白分子病導致一個蛋白質(zhì)中氨基酸改變的基因突變能產(chǎn)生所謂分子病，這是一種遺傳病與有缺陷的血紅蛋白有關的疾病分為兩類：一類稱為血紅蛋白病是由于α或β鏈發(fā)生了變化，例如鐮刀狀細胞貧血病等；另一類稱為地中海貧血，是由于缺少了α或β鏈，例如α-和β-地中海貧血病鐮刀狀細胞貧血病由于遺傳基因突變導致血紅蛋白分子中氨基酸殘基的替代所造成的是一個反映出蛋白質(zhì)的氨基酸序列在決定它的構象及其生物學功能方面的重大作用的典型例子。HbAH2NVal-His-leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-HbSH2NVal-His-leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-12345678鐮刀形紅細胞正常紅細胞小結蛋白質(zhì)分子結構與功能的關系：（1）每種蛋白質(zhì)分子都具有其特定的結構來完成它特定的功能，甚至只有個別氨基酸的變化就能引起功能的改變或喪失，結構與功能之間具有高度統(tǒng)一性。（2）蛋白質(zhì)的構象與功能的關系十分密切。構象改變時，功能也會發(fā)生改變；蛋白質(zhì)構象的破壞，可引起功能的喪失。（遼寧師范大學2005年）討論蛋白質(zhì)構象與功能的關系蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮必須以特定構象為基礎，兩者密切相關。（1）變性、復性，構象改變，生物學活性改變(2)酶原激活等例子都說明通過改變一級結構而改變空間結構，從而酶活改變（3）肌紅蛋白與血紅蛋白a、b

結構相似，具有相似的功能。其特定的結構維持了結合氧的能力。血紅蛋白為四聚體，具有變構現(xiàn)象使得輸氧能力高度有效。（4）酶與底物結合過程中的誘導契合第七節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)是相對分子質(zhì)量（relativemolecularmass,Mr）很大的生物大分子，其Mr變化范圍在6000—1000000或更大一些。（一）根據(jù)化學組成測定最低Mr

假定某種微量成分只有一個，測出其百分含量后，可用比例式算出最低相對分子質(zhì)量。若測出兩種微量成分的百分含量，分別用比例式算出的最低相對分子質(zhì)量不相同時，可計算兩個最低相對分子質(zhì)量近似的最小公倍數(shù)。真實Mr=最低Mr×n（n是每個分子中元素原子的數(shù)目）舉例：1、肌紅蛋白Fe：0.335%MFe

：55.8

Mr：16700n=12、血紅蛋白Fe：0.335%MFe：55.8最低Mr：16700別法Mr：68000n=4真實Mr：16700

×4＝66800氨基酸的定量分析表明牛血清清蛋白含有0.58%的色氨酸（色氨酸的相對分子質(zhì)量為204）。（1）試計算牛血清清蛋白的最小相對分子質(zhì)量（假設每個蛋白分子只含有一個色氨酸殘基）。（2）凝膠過濾測得的牛血清清蛋白的相對分子質(zhì)量為70000,試問牛血清清蛋白分子含有幾個色氨酸殘基？解：(1)0.58:100=204:Mr,Mr=204x100/0.58=35172.41(2)70000/35172.41≈2（二）滲透壓法測定相對分子質(zhì)量半透膜（semipermeab1emembrane）滲透壓（osmoticpressure）理想溶液中，溶液的滲透壓與溶質(zhì)濃度的關系可用范托夫（van’tHoff）公式表示：滲透壓半透膜溶劑蛋白質(zhì)溶液范托夫（van’tHoff）公式

π=nRT/V=(g/Mr)RT/V

即

π=(g/V)RT/Mr=cRT/Mr式中π中滲透壓(N/m2即Pa)V是溶液體積(m3)，n是溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù)；g是溶質(zhì)的質(zhì)量(g)；c是溶質(zhì)的濃度(g/m3)；T是絕對溫度(K)；R是氣體常數(shù)[8.314J/(K·mol)]；Mr是溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量或稱摩爾質(zhì)量(g/mol)。從上式看出，理想溶液中滲透壓是濃度的線性函數(shù)，實際的高分子溶液與濃度之間不是簡單的線性關系。在濃度不大時，它們的關系用下式表示：用稀釋法（外延法）：利用滲透壓的測定來計算蛋白質(zhì)Mr時，實際上都是測定幾個不同濃度的滲透壓，以π/c對c作圖并外推到蛋白質(zhì)濃度為0時所得截距，即limπ/c值，代入公式求出Mr.對于相對分子質(zhì)量10000至100000范圍的蛋白質(zhì)利用滲透壓法估算其Mr，可以給出可靠的結果π=RT(cMr+Kc2)πc=RTMr+KcMr=RTLimπ/cc→0（三）超離心法測定相對分子質(zhì)量利用超速離心機測定蛋白質(zhì)或其他生物大分子的相對分子質(zhì)量，常用的有兩種方法：一種是沉降速率法（sedimentationvelocity），另一種是沉降平衡法（sedimentationequilibrium）。－－被認為是最準確可靠的方法基本原理：⒈離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）：當一個粒子（生物大分子或細胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“Fc”由下式定義：F=m·a=m·ω2ra—粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，m—沉降粒子的有效質(zhì)量，ω—粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，r—粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)。

⒉相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結果。RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（revolutionsperminute,簡寫成r/min,或rpm）。22⒊沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，s）：

1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義為顆粒在單位離心力場中移動的速度。

若ω用2πn/60表示，則

X1：離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2：離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S：沉降系數(shù)，時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。例如，動物原生質(zhì)核糖體的沉降系數(shù)等于80S，它的含義就是：80×10-13s。細胞及細胞的各組分的沉降系數(shù)有很大的差異，所以可以利用生物樣品沉降系數(shù)的差異采用離心技術將他們彼此分開。

4.沉降系數(shù)與物質(zhì)相對分子質(zhì)量:

根據(jù)Svedberg公式，由沉降系數(shù)可以計算出物質(zhì)的相對分子質(zhì)量：

Mr=RTs20,W/[D20,W(1-γρ)]

Mr:相對分子質(zhì)量；D20,W：以20℃的水為介質(zhì)時顆粒的擴散系數(shù)；R:氣體常數(shù)；T：絕對溫度；s20,W：以20℃的水為介質(zhì)時顆粒的沉降系數(shù)；γ：偏微比容，等于溶質(zhì)粒子密度的倒數(shù)；ρ：溶劑密度（四）凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量利用凝膠過濾（gelfiltration）可以把蛋白質(zhì)混合物按分子的大小分離開來。這種方法比較簡便，不要求復雜的儀器就能相當精確地測出蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體具有相同的過柱速度即相同的洗脫體積，則認為這種蛋白質(zhì)具有與此球體相同的半徑，稱蛋白質(zhì)分子的斯托克半徑當含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。

若以組分的洗脫體積(Ve)對組分相對分子質(zhì)量的對數(shù)(lgMr)作圖，可得一曲線，其中主要部分成直線關系。以此為標準曲線，可以通過測定某一未知組分的洗脫體積，而從標準曲線中查得其相對分子質(zhì)量。在實際應用中多以相對洗脫體積Kav(Kav=Ve/Vt)對lgMr作曲線，稱為選擇曲線，曲線的斜率說明凝膠的特性。每一類型的化合物，如球蛋白類、右旋糖酐類、酶與清蛋白類等都有各自特定的選擇曲線。測定時，未知相對分子質(zhì)量的組分應位于直線部分為宜。若不在直線部分，可選用另一種凝膠重新試驗。洗脫曲線logMr洗脫體積（mL）ABCCBA未知洗脫體積與Mr的關系測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量一般用交聯(lián)葡聚糖，Sephadex。如SephadexG-75(3000~80000),G-100(4000~150000)（五）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量電泳時，蛋白質(zhì)顆粒在各種介質(zhì)中的遷移率決定于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1967年Shapiro等人發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率（e1ectrophoreticmobility）主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與原來所帶的電荷和分子形狀無關SDS在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結合比為1.4克SDS／l克蛋白質(zhì)，相當于每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子。SDS與蛋白質(zhì)的結合：第一，由于SDS是陰離子，使多肽鏈覆蓋上相同密度的負電荷，該電荷量遠超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，結果所有的SDS-蛋白質(zhì)復合體，電泳時都以同樣的電荷／蛋白質(zhì)比向正極移動。第二，改變了蛋白質(zhì)單體分子的構象，SDS-蛋白質(zhì)復合體在水溶液中的形狀被認為是近似雪茄煙形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復合體的短軸長度（直徑）都是一樣的約為1.8nm，而長軸長度則隨蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量成正比例變化電泳遷移率（μR）與多肽鏈分子量的對數(shù)有下列關系a和b、K1和K2都是常數(shù)以幾種相對分子量已知的標準蛋白質(zhì)的Mr的對數(shù)值對μR作圖，根據(jù)待測樣品的μR，從其標準曲線上查出分子量logMr=a-bμR

或logMr=K1–K2μR

μR=

樣品遷移距離前沿（染料）遷移距離二、蛋白質(zhì)的兩性解離和等電點對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH，它所帶的正電荷與負電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH稱為蛋白質(zhì)的等電點

沒有其他鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團結合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH稱為等離子點（isoionicpoint），等離子點是蛋白質(zhì)的一個特征常數(shù)蛋白質(zhì)在其等電點偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負電荷，在等電點pH時為兩性離子。電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶電荷的正負性和多少不同，遷移率即異，在電泳時可以分開。自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進行電泳。區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點在浸了緩沖液的支持物上進行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。-+（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：在玻璃管中進行的凝膠電泳。+—2）平板電泳：在鋪有凝膠的玻板上進行的電泳。等電聚焦電泳：當?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

由于蛋白質(zhì)分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征。可溶性蛋白質(zhì)分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化層，同時這些顆粒帶有電荷，因而蛋白質(zhì)溶液是相當穩(wěn)定的親水膠體。++++++

蛋白質(zhì)透析法:利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的的性質(zhì)，將含有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液放入透析袋再置于流水中，小分子雜質(zhì)被透析滲出，大分子蛋白質(zhì)留在袋中，以達到純化蛋白質(zhì)的目的。這種方法稱為透析（dialysis）。布郎運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化）；2）帶相同電荷。四、蛋白質(zhì)的沉淀反應如果加入適當?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。加高濃度鹽類（鹽析、鹽溶）加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出－－鹽析分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。加有機溶劑加重金屬鹽加某些酸類和生物堿試劑單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。5.加熱變性沉淀制備有活性的蛋白質(zhì)應注意的問題

五、蛋白質(zhì)變性與復性

蛋白質(zhì)各自所特有的高級結構，是表現(xiàn)其物理性質(zhì)和化學特性以及生物學功能的基礎。

當天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學因素的影響，其分子內(nèi)部原有的高級構象發(fā)生變化，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學功能都隨之改變或喪失，但并未導致其一級結構的變化，這種現(xiàn)象稱為變性（denaturation）。*蛋白質(zhì)變性學說，我國生物化學家吳憲在上個世紀20-30年代已經(jīng)提出。天然蛋白質(zhì)分子因環(huán)境的種種關系，從有序而緊密的結構，變?yōu)闊o序而松散的結構，這就是變性。他認為天然蛋白質(zhì)的緊密結構以及晶體結構是由分子中的次級鍵維系的，所以容易被物理的和化學的因素所破壞。這種觀點基本上反映了蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)。1、生物活性喪失（Inactivation）2、一些側(cè)鏈基團暴露3、蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)改變易沉淀（熱變性、酸變性等）堿、脲、鹽酸胍變性（溶解性很好）粘度增加、擴散系數(shù)降低CD、紫外、熒光發(fā)射光譜等發(fā)生明顯變化4、生物化學性質(zhì)改變

易被蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)變性過程將導致變性蛋白質(zhì)分子互相凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固。應用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……蛋白質(zhì)的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程。

變性蛋白質(zhì)在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來的構象，恢復原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復性（renaturation）。1.（寧波大學2005年）什么是蛋白質(zhì)變性作用？引起蛋白質(zhì)變性的因素有哪些？解析：主要明確蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)：空間結構的破壞而引起的生物學活性、物理化學性質(zhì)的改變。反應名稱試劑顏色反應有關基團有此反應的蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應Hg(NO2)2、Hg(NO3)2及HNO2混合物紅色

Tyr黃色反應濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(Hopking-Cole反應)乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(Sakaguchi反應)α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(Folin-Cioculteu反應)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應茚三酮藍色自由氨基及羧基α-氨基酸

六、蛋白質(zhì)的顏色反應—OHN七、蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)在遠紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對蛋白質(zhì)進行定性定量分析。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260測定范圍：0.1～0.5mg/ml第八節(jié)蛋白質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)純化的總目標是增加制品的純度（purity）或比活（specificactivity），以增加單位蛋白質(zhì)重量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性（比活常以活力單位數(shù)/克蛋白質(zhì)表示）。設法除去變性的和不要的蛋白質(zhì)，并且希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達到最高值。蛋白質(zhì)分離純化的一般原則1.前處理要選擇合適的材料;合適的破碎方法;合適的提取液。2.粗分級分離要方法簡便，處理量大。常用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法，有時可用超過濾或凝膠過濾等方法。3.細分級分離主要使用各種層析、電泳，方法要精心選擇，巧妙配合。后期可用結晶法。蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的下列性質(zhì)分離純化蛋白質(zhì)的方法：①分子大?、谌芙舛娶垭姾散芪叫再|(zhì)⑤對配體分子的生物學親和力等（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超濾(1)透析透析是把待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進行的，透析液可以更換，直至透析袋內(nèi)無機鹽等小分子物質(zhì)降到最小值為止。原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機鹽、單糖等分開。

磁力攪拌器磁棒透析液蛋白質(zhì)溶液半透膜袋2.超濾：

利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的。超濾是一種膜分離技術，它的特點是使用不對稱多孔膜根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮、不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和、非變性的物理方法，比其它分離方法有效率更高、更靈活的優(yōu)點。原理：

在外力作用下，超濾膜對大分子物質(zhì)的截留主要是篩分作用，決定截留效果的主要是膜的表面活性層上孔的大小與形狀。除了篩分作用外，膜表面、微孔內(nèi)的吸附和粒子在膜孔中的滯留也使大分子被截留?，F(xiàn)在已有各種市售的超濾膜裝置可供選用，有加壓、抽濾和離心等多種形式。濾膜也有多種規(guī)格，他們截留相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)。使用中最需注意的問題是濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，使超濾速度減慢，能被截留物質(zhì)的Mr變小。圖7-6利用壓力和離心力的超過濾濾膜抽氣離心超濾的主要應用：濃縮：使用超濾來增加所需大分子溶質(zhì)的濃度，即大分子被超濾膜截留而小分子和溶劑可自由通過，從而達到濃縮的目的。梯度分離：按分子大小梯度分離樣品中的溶質(zhì)分子時，超濾是一種經(jīng)濟有效的方法，適用于分離相對分子質(zhì)量相差10倍以上的分子組分。在超濾過程中，雖然截留的大分子被濃縮，但濾過的溶質(zhì)分子仍保持初始的濃度。脫鹽／純化：脫鹽即從大分子溶液中去除鹽、非水性溶劑和小分子物質(zhì)的過程。通過溶劑交換，可最有效地去除溶液中的小分子物質(zhì)，并逐漸分離純化出大分子物質(zhì)。具體方法為：在溶液進行超濾的同時，不斷向溶液中補充溶劑，補充溶劑的速度與溶液濾過速度相同，使體系始終保持恒定，這種方法又稱透析超濾法。2、密度梯度（區(qū)帶）離心介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、聚蔗糖（Ficoll)、葡聚糖等滴加樣品4%8%12%16%20%3、凝膠過濾——分子排阻是根據(jù)分子大小分離混合物最有效的方法之一。（1）凝膠過濾的介質(zhì)凝膠的交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。Q定了凝膠的分級分離范圍（fractionationrange）排阻極限（exc1usionlimit）來表示分級分離范圍的上限，它被定義為不能擴散進入凝膠珠微孔的最小分子的Mr，例如sephdexG-50的排阻極限是30000。凝膠的粒度與洗脫流速和分辨率有關。顆粒通常用篩眼數(shù)或目數(shù)（meshsize）或珠直徑（um）表示。（2）凝膠過濾的原理凝膠過濾層析的基本原理水化的凝膠顆粒凝膠過濾當含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。

樣品中各組分的流出順序，可用分配系數(shù)Ka來量度：

Ka=(Ve-Vo)/Vi

式中Ve：為洗脫體積(elutionvolume)，表示某一組分從層析柱洗出到最高峰出現(xiàn)時，所需的洗脫液體積；Vo：外體積(outervolume)，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積。Vi：內(nèi)體積(innervolume)，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積。

當某組分的Ka=0時(即Ve=Vo)，說明該組分完全不進入凝膠顆粒微孔，洗脫時最先流出。

若某組分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)時，說明該組分可自由地擴散進入凝膠顆粒內(nèi)部的微孔中，洗脫時，最后流出。Ka在0-1之間的組分，洗脫時Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。

(二)利用溶解度差別的純化方法1.等電點沉淀和pH控制

利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點一這特性，對蛋白質(zhì)進行分離純化的方法稱為等電點沉淀法。在等電點時，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，消除了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用。單獨使用等電點法主要是用于去除等電點相距較大的雜蛋白。在加酸或加堿調(diào)節(jié)pH的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加入，以防止局部過酸或過堿。pH溶解度（蛋白mg/ml）NaCI該圖說明：（1）b-乳球蛋白的溶解度在其等電點

(pH5.2~5.3)時達到最低值，在等電點兩側(cè)的pH下，其溶解度迅速提高；（2）NaCl濃度對pH與溶解度的關系無多大影響2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；

原因：主要由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白分子彼此排斥，而蛋白分子與水分子間的相互作用卻加強當鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達到彼此分離的目的。

原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從溶液中析出。離子強度（I）Log（溶解度）在等電時，中性鹽（K2SO4)對一氧化碳血紅蛋白的溶解度的影響

鹽能夠改變蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強度有密切關系。兩者的關系可用下式表示：

lg（S/So）=-KsI

S為蛋白質(zhì)在離子強度為I時的溶解度(g/L)；So為蛋白質(zhì)在離子強度為0時的溶解度；Ks為鹽析常數(shù)；I為離子強度。在溫度一定的條件下，某一蛋白質(zhì)在某一pH值的水溶液中的溶解度為一常數(shù)So。故上式可改寫為：

lgS=lgSo–KsI=β–KsI

β=lgSo為一常數(shù)，主要取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也與溶液的溫度和pH值有關；鹽析常數(shù)Ks主要與鹽的性質(zhì)(離子價數(shù)、平均半徑等)和蛋白質(zhì)的結構有關，Ks越大，鹽析效果越好。

所以對某一蛋白質(zhì)來說，在溫度和pH值等鹽析條件確定(即β確定)，所采用的鹽確定(即Ks確定)以后，蛋白質(zhì)的溶解度決定于離子強度I,I可用下式計算：

I=1/2∑miZi2

mi:溶液中離子的摩爾濃度Zi：離子的價數(shù)

對于多種蛋白質(zhì)或酶的混合液，可采用分段鹽析法進行分離純化。鹽的選擇：

蛋白質(zhì)的鹽析通常采用中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應用最廣的是硫酸銨。

硫酸銨是一中性鹽，對蛋白質(zhì)有相當好的安定作用。又因為其離子容積較大，吸走水分子的能力也大，成為有效的鹽析工具。硫酸銨在水中的溶解度大而溫度的影響小(25℃時溶解度為4.1mol/L，即767g/L;0℃時溶解度為3.7mol/L，即697g/L)，而且價廉易得，不易引起蛋白質(zhì)變性，分離效果比其他鹽好。但是用硫酸銨鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子會干擾蛋白氮的測定，故有時也要用其他鹽來進行鹽析。磷酸鉀和硫酸鈉的鹽析系數(shù)Ks較大，但由于溶解度受溫度影響大，故應用不廣泛。硫酸銨濃度的計算與調(diào)整方法

通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示(不是濃度百分比)，例如大部分蛋白質(zhì)可在80%硫酸銨飽和度下沉淀。因為硫酸銨加入的體積很大，會改變最后的總體積，很難由濃度百分比來計算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。用硫酸銨進行鹽析時，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨濃度的調(diào)整方法主要有二種：（1）加入飽和溶液法

要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高

V=V0(S2-S1)/（1-S2）

V:所需加進的飽和硫酸銨溶液的體積；V0:原溶液的體積；S2：所需達到的硫酸銨飽和度；S1:原溶液的硫酸銨飽和度。飽和硫酸銨的配制方法：在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至50－60℃，趁熱濾去沉淀，再在0℃或室溫平衡1－2天，有固體析出時達100％飽和度。(2)

加入固體鹽法

要求：飽和度高，不增大溶液體積

t=G(S2-S1)/（1-AS2）

S2，S1:分別代表所需達到的硫酸銨飽和度和原溶液的硫酸銨飽和度；t：將1LS1飽和度的溶液提高到S2飽和度時所需加進的硫酸銨克數(shù)；G和A為常數(shù)，與溫度有關。實際使用時，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃兩張表，室溫用25℃）3.有機溶劑分級分離法（1）作用機理：降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)溶解度降低；破壞大分子周圍水膜，使溶解度降低。利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，稱為有機溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機溶劑是乙醇和丙酮。（2）優(yōu)點：

比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去。

（3）缺點：

有機溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)和酶變性，所以操作必須在低溫條件下進行。蛋白質(zhì)和酶沉淀分離后，應立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度，避免變性。

中性鹽可減少有機溶劑引起的蛋白質(zhì)變性，提高分離效果，一般添加0.05mol/L的中性鹽。由于中性鹽會增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度，故中性鹽不宜添加太多。

有機溶劑沉淀法一般與等電點沉淀法聯(lián)合使用。即操作時溶液的pH值應控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點附近。4.溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響

a.在低離子強度或純水中，溫度升高，溶解度增加；b.在高鹽溶液中，溫度升高，溶解度降低。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，所以蛋白質(zhì)的分級分離一般在低溫下操作。一般在室溫下進行鹽析，溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫4℃進行。

(三)根據(jù)電荷不同的純化方法1.電泳帶電顆粒在電場中泳動的速度稱遷移率或泳動度(mobility)，可用下式表示：

U=v/E=(d/t)/(V/l)=dl/Vt

式中，U(也可以用m表示)為泳動度(cm2/Vs)；v為顆粒泳動速度(cm/s)；E為電場強度(V/cm)；d為顆粒移動的距離；l為支持物的有效長度(cm)；V為實際電壓(V)；t為通電時間(s或min)。電泳后通過測量V,t,d,l，即可計算出被分離物質(zhì)的泳動度。

泳動度與帶電顆粒所帶凈電荷的數(shù)量，顆粒大小和形狀有關。一般說，凈電荷數(shù)量愈多，顆粒愈小，愈接近球形，泳動度愈大。被分離的球形分子在電場中所受的力(F)為：

F=EQ式中，E為電場強度，即每厘米支持物的電位降，Q為被分離物所帶凈電荷。根據(jù)Stoke定律，一球形分子在液體中泳動所受的阻力(摩擦力)F′為：

F′=6πrηv

式中，η為介質(zhì)粘度，r為分子半徑，v為分子移動速度。當平衡時：F=F′，即

EQ=6πrηv∴v=EQ/6πrη∵U=v/E∴U=Q/6πrη

由上式可見泳動度與球形分子半徑、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷有關。

經(jīng)典電泳：自由電泳或稱移動界面電泳瑞典的Tisellius于1930年設計出來區(qū)帶電泳根據(jù)支持物的物理性質(zhì)分為：①濾紙電泳和薄膜電泳②粉末電泳：淀粉、纖維素功硅膠粉等③細絲電泳：人造絲、尼龍絲等細絲支持物上的電泳④凝膠電泳：最常用的有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠水平式平板凝膠電泳垂直式平板凝膠電泳2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。凝膠的聚合常用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。TEMED的堿基可催化AP水溶液產(chǎn)生游離氧原子，激活Acr單體，使其聚合成單體長鏈，在Bis作用下，聚合成網(wǎng)狀凝膠。堿性條件下凝膠易聚合，室溫下7.5%的凝膠在pH8.8時30min聚合，在pH4.3時約需90min。

此外，核黃素亦可為催化劑，聚合需光照，故使用不多。凝膠柱或凝膠板濃縮膠分離膠凝膠的濃度（孔徑大?。?、緩沖液組分和離子強度、pH以及電場強度都是不同的，即不連續(xù)的有3種物理效應：①樣品的濃縮效應；②凝膠對被分離分子的分子篩選效應（顆粒小的移動快，顆粒大的移動慢）；③一般電泳分離的電荷效應。由于這3種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高

聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。(2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學反應。(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定。(4)幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好。(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g。(6)凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。PAGE應用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定相對分子質(zhì)量、等電點等。

3.等電聚焦

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當pH＞pI時帶負電荷，在電場中向正極移動；當pH＜pI時帶正電荷，在電場中向負極移動；當pH=pI時凈電荷為零，在電場中既不向正極也不向負極移動，此時的pH就是該蛋白質(zhì)的等電點(pI)。各種蛋白質(zhì)由不同的氨基酸以不同的比例組成，因而有不同的pI。利用pI不同，以PAG為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes，商品名稱為ampholine），它是脂肪族多胺和多羧類的同系物，它們具有相近但不相同的pKa和pI值。在電場作用下，兩性電解質(zhì)載體在凝膠中移動，形成pH梯度，蛋白質(zhì)在凝膠中遷移至其pI的pH處，即不再泳動而聚焦成帶，這種方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(isoelectricfocusing,簡釋IEF)。

IEF可用于蛋白質(zhì)等電點的測定.4.雙向電泳

IEF/SDS(IPG/SDS)雙向PAGE電泳是由兩種類型的PAGE組合而成。樣品經(jīng)第一向電泳分離后，再以垂直它的方向進行第二向電泳。如這二向電泳體系pH及凝膠濃度完全相同，則電泳后樣品中不同組分的斑點基本上呈對角線分布，對提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根據(jù)不同生物分子間等電點及相對分子質(zhì)量不同的特點，建立了以第一向為IEF，第二向為SDS-PAGE的雙向分離技術，簡稱為IEF/SDS；基本原理與IEF，SDS完全相同。一般第一向IEF用超薄水平板，電泳結束后切取所需泳道用于第二向電泳，或在1mm內(nèi)徑的毛細管中進行第一向IEF，取出膠條用于第二向電泳。第一向電泳的方法同IEF，只是制膠時要加入2%兩性電解質(zhì)和6mol/L尿素。第二向電泳時，先將SDS-PAG灌在垂直玻璃板之間，上部留2cm左右空間，待聚合后，將第一向膠條轉(zhuǎn)移到第二向膠之上，用載玻片將膠條輕輕壓直，加3μL1%溴酚蘭指示劑，用1%的瓊脂糖(用電極緩沖液配制)密封膠條，瓊脂糖凝固后即可電泳。待溴酚蘭將至凝膠板下方邊緣時，停止電泳。第二向電泳時，用梯度混合器將凝膠制成7.5%-15%的濃度梯度，可以提高電泳的分辨率。5．離子交換層析(1)離子交換劑離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(或功能基團)和反離子構成的，基質(zhì)與電荷基因以共價鍵連接，電荷基因與反離子以離子鍵結合。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，假設以RA+代表陽離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆的交換反應，反應式為：RA++B+RB++A+

離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結合力，這種結合力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。強酸性(陽性)離子交換劑對H+的結合力比對Na+的??；強堿性(陰性)離子交換劑對OH-的結合力比對Cl-的小得多；弱酸性離子交換劑對H+的結合力遠比對Na+的大；弱堿性離子交換劑對OH-的結合力比對Cl-的大。因此，在應用離子交換劑時，采用何種反離子進行電荷平衡是決定吸附容量的重要因子之一。離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發(fā)生水化作用形成的)的結合力與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。所以，離子價數(shù)越高，結合力越大。在離子間的電荷相同時，離子的原子序數(shù)越高，水合離子半徑越小，結合力越大。支持介質(zhì)為纖維素離子交換劑

具有松散的親水性網(wǎng)狀結構，較大表面積，大分子可以自由通過，因此交換容量大，適于大分子的分離CM-纖維素（陽離子交換劑）DEAE-纖維素（陰離子交換劑）交聯(lián)葡聚糖離子交換劑

容量比纖維素離子交換劑大3~4倍根據(jù)分子的凈電荷數(shù)量和分子大小分離(2)洗脫方法在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進行洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。梯度溶液按組成來分，一般有二種：一種是增加離子強度的梯度溶液。是用一簡單的鹽(如NaCl或KCl)溶解于稀緩沖液制成的，習慣上不用弱酸或弱堿的鹽類；另一種是改變pH值的梯度溶液。該溶液是用兩種不同pH值或不同緩沖容量的緩沖液制成的，所用緩沖液的種類、pH值以及緩沖容量要認真選擇，否則將達不到預期目的。對于增加離子強度的梯度溶液，不管用于何種類型的離子交換劑，其離子強度絕大部分是增加的。而改變pH值的梯度溶液則不然，如果使用的是陽離子交換劑，pH值應從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑，pH值應從高到低遞減，實際許可的pH值范圍由待分離物質(zhì)的穩(wěn)定pH范圍和離子交換劑限制的pH范圍來決定。(四)利用選擇性吸附的純化方法1.羥基磷灰石層析羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2(簡稱HA)]的吸附容量高，穩(wěn)定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒和其它生命物質(zhì)方面得到了廣泛的應用。有時有些樣品如RNA、雙鏈DNA、單鏈DNA和雜合型雙鏈DNA-RNA等，經(jīng)過一次HA柱層析，就能達到有效的分離。

HA的Ca2+基團和生物分子表面的負電荷基團的相互反應，在用HA分離生物分子過程中起著重要作用。而HA的PO43-基團與生物分子表面的陽電荷基團的相互反應，則僅起著次要的作用。2.疏水作用層析根據(jù)蛋白質(zhì)表面的疏水性差別發(fā)展起來的一種純化技術。以苯基瓊脂糖或辛基瓊脂糖為固體支持物，與蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)相互作用，用降低離子強度或增加置換劑的方法洗脫。常用的置換劑有非離子型去污劑、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用層析容易引起蛋白質(zhì)變性，在蛋白質(zhì)分離中使用不廣。(五)利用對配體的特異生物學親和力的純化方法

親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術。具有專一而又可逆的親和力的生物分子是成對互配的。主要的有：酶和底物、酶與競爭性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結合蛋白等。在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液中的另一方分子進行親和層析，達到分離純化目的。例如，酶與其輔酶是成對互配的，既可把輔酶作為固定相，使樣品中的酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中的輔酶分離純化。

親和層析基本原理是把待純化的某一蛋白質(zhì)的特異配體通過適當?shù)幕瘜W反應共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類載體的表面的功能基（-OH)上構成親和介質(zhì)（固定相）。配基是指能被生物大分子識別并與之結合的原子、原子團和分子，如酶的底物、輔酶、調(diào)節(jié)效應物及其結構類似物，激素與受體蛋白、抗原與抗體。親合層析原理得到純化的蛋白雜蛋白不與配體分子結合親合洗脫(六)高效液相層析和快速蛋白液相層析

高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，又稱高壓液相色譜法、高速液相色譜法、現(xiàn)代液相色譜法等，是在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎上發(fā)展起來的分析技術。特別適用于高沸點、不能氣化或熱穩(wěn)定性差的有機物分離分析，在生物化學與分子生物學中的應用日益廣泛。

HPLC在高壓下使液體通過色譜柱，在室溫條件下分離混合組分，經(jīng)檢測器轉(zhuǎn)變成電信號，由記錄器描記或數(shù)據(jù)處理裝置顯示測定結果，具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特點。1.高壓：由于HPLC是以液體作為流動相，而液體比氣體通過色譜柱時所受的阻力要大得多，所以必須施加高壓，一般為15-30MPa，最高可達50MPa。

2.高速：由于HPLC采用了高壓，使流動相液體的流速加快，一般分析周期為數(shù)分鐘至數(shù)10分鐘，比經(jīng)典的液相柱色譜要快得多，但比GC稍慢。3.高效：由于HPLC的柱效較高(每米塔板數(shù)可達5000)，有時一根柱子可分離數(shù)十種乃至上百種組分。4.高靈敏度：采用靈敏的檢測器和自動化裝置，可檢出10-9g乃至10-11g的物質(zhì)；所需試樣量很少，通常只需數(shù)十微升試樣即可進行全分析。由于HPLC具有以上特點，所以70年代以來得到了迅速的發(fā)展。一般認為，對于有機物的色譜分析，當其相對分子質(zhì)量小、沸點較低時，可用GC進行分析；沸點較高(＞450℃)、不能氣化或熱穩(wěn)定性差者，可用HPLC分析；如果條件不允許，無法購置昂貴的儀器時，可用TLC等經(jīng)典液相色譜進行分析。

蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定（一）蛋白質(zhì)含量測定生物活性的測定和總蛋白量的測定配合起來，可以用來表示蛋白質(zhì)分離過程中某一特定蛋白質(zhì)的純化程度。純化程度常用這一特定成分的含量（一般用活力單位）與總蛋白量（重量單位）之比來表示。對酶來說常以每毫克蛋白所含活力單位數(shù)表示，稱為酶比活或比活力測定蛋白質(zhì)總量的方法凱氏定氮法：經(jīng)典的標準方法，現(xiàn)不多用雙縮脲法：快速但不十分精確Folin-酚試劑法(Lowry法)：標準測定方法紫外吸收法（280nm):精確度不高，但簡便，樣品可回收，可估算核酸含量Bradford法（考馬斯亮藍結合法）：靈敏度高，檢測1微克蛋白，重復性好膠體金測定法：靈敏度最高，納克水平。膠體金是帶負電荷的疏水膠體，洋紅色，遇蛋白質(zhì)變藍色。（二）蛋白純度的鑒定蛋白質(zhì)純度鑒定通常采用物理化學的方法，如電泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。目前采用的電泳分析有等電聚集、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和SDS一PAGE、毛細管電泳等在這些分析的圖譜上只呈現(xiàn)一個峰或一個條帶圖7-20蛋白質(zhì)的溶解度曲線加入的固體蛋白質(zhì)的量溶解的蛋白質(zhì)的量只有一個折點的表明是純的下列蛋白質(zhì)的混合物在什么pH時電泳，分離最有效？(1)血清清蛋白和血紅蛋白(2)肌紅蛋白和胰凝乳蛋白酶原(3)卵清蛋白、血清清蛋白和脲酶解答:(1)血清清蛋白pI=4.9,血紅蛋白pI=6.8(4.9+6.8)/2=5.85,在pH5.85時電泳，分離最有效。樣品點在中間，血清清蛋白移向陽極,血紅蛋白移向陰極。

(2)肌紅蛋白pI=7.0,胰凝乳蛋白酶原pI=9.5,(7.0+9.5)/2=8.25,在pH8.25時電泳，分離最有效。樣品點在中間，肌紅蛋白移向陽極,胰凝乳蛋白酶原移向陰極。

(3)卵清蛋白pI=4.6,血清清蛋白pI=4.9,

脲酶pI=5.0,在pH4.9時電泳，分離最有效。樣品點在中間，血清清蛋白不動，卵清蛋白移向陽極,脲酶移向陰極。2.指出下列蛋白質(zhì)在分離范圍為5000～400000的凝膠過濾柱上洗脫下來的先后順序。肌紅蛋白、過氧化氫酶、細胞色素C、肌球蛋白、胰凝乳蛋白酶原、血清清蛋白。解答：凝膠過濾是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物的最有效的方法之一。相對分子質(zhì)量大的比相對分子質(zhì)量小的先被洗脫下來。根據(jù)各蛋白的相對分子質(zhì)量，洗脫下來的先后順序：肌球蛋白，過氧化氫酶，血清清蛋白，胰凝乳蛋白酶原，肌紅蛋白，細胞色素C3.用增加鹽離子強度的方法，從指定的離子交換柱上洗脫下列蛋白質(zhì)，指出它們被洗脫下來的先后順序，并說明理由。細胞色素C、溶菌酶、卵清蛋白、肌紅蛋白（陰離子交換柱）細胞色素C、胃蛋白酶、脲酶、血紅蛋白（陽離子交換柱）解答：離子交換層析主要根據(jù)物質(zhì)所帶電荷不同而予以分離。一個蛋白質(zhì)帶的負電荷越多，它與陰離子交換劑結合愈緊密，而與陽離子交換劑的結合能力愈弱。細胞色素C的pI=10.6、溶菌酶pI=11.0、卵清蛋白pI=4.6、肌紅蛋白pI=7.0,所以洗脫下來的先后順序為溶菌酶，細胞色素C，肌紅蛋白，卵清蛋白（陰離子交換柱）。(2)細胞色素C的pI=10.6、胃蛋白酶pI=1.0、脲酶pI=5.0、血紅蛋白pI=6.8,所以洗脫下來的先后順序為胃蛋白酶,脲酶,血紅蛋白,細胞色素C（陽離子交換柱）。

4.扼要解釋為什么大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在溶液中具有下列性質(zhì)。(1)在低pH值時沉淀(2)當離子強度從零逐漸增加時，其溶解度開始增加，然后下降，最后出現(xiàn)沉淀(3)在一定的離子強度下，達到等電點pH值時，表現(xiàn)出最小的溶解度(4)加熱時沉淀(5)加入一種可與水混溶的非極性溶劑減小介質(zhì)的介電常數(shù)，而導致溶解度的減小(6)如果加入一種非極性強的溶劑，使介電常數(shù)大大的下降會導致變性解答：(1)在低pH值時，羧基質(zhì)子化，蛋白質(zhì)分子帶有大量的正電荷，分子內(nèi)正電荷相斥使許多蛋白變性，隨著分子內(nèi)部疏水基團的向外暴露使蛋白質(zhì)溶解度降低，因而產(chǎn)生沉淀。(2)加入少量鹽時，對穩(wěn)定帶電基團有利，使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，并加強與水分子間的相互作用，溶解度增高。隨著鹽離子濃度的增加，鹽離子奪取了與蛋白質(zhì)結合的水分子，降低了蛋白的水合程度，使蛋白質(zhì)的水化層破壞，使蛋白質(zhì)沉淀。(3)等電點時，蛋白質(zhì)靜電荷為零，分子之間的斥力最小，所以溶解度最小。(4)加熱會使蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團被暴露，溶解度降低，從而引起蛋白質(zhì)沉淀。(5)非極性溶劑減小了表面極性基團的溶劑化作用，促使蛋白質(zhì)分子之間形成氫鍵，從而取代了蛋白質(zhì)分子與水之間的氫鍵。(6)介電常數(shù)的下降對暴露在溶劑中的非極性基團有穩(wěn)定作用，結果促使蛋白質(zhì)肽鏈的展開而導致變性5.凝膠過濾和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳這兩種分離蛋白質(zhì)的方法均建筑在分子大小的基礎上，而且兩種方法均采用交聯(lián)的多聚物作為支持介質(zhì)，為什么在凝膠過濾時，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)有較長的保留時間，而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它又跑得最快？解答：凝膠過濾常用的是葡聚糖凝膠（Sephadex)，該介質(zhì)排阻相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，僅允許相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)進入顆粒內(nèi)部，所以相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)只能在凝膠顆粒之間的空隙中通過，它通過柱的體積為柱床體積減去凝膠顆粒本身所占的體積。而相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)必須通過所有的床體積才能流出，所以相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)比相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)有較長的保留時間。而SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其凝膠介質(zhì)并不存在像Sephadex那樣的顆粒之間的空隙，所有的蛋白質(zhì)分子必須全部通過這交聯(lián)介質(zhì)而移動。蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量愈小，通過介質(zhì)愈快，移動愈迅速。6.在一抽提液中含有三種蛋白質(zhì)，其性質(zhì)如下：蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量等電點A200008.5B210005.9C50006.0解答：由于蛋白質(zhì)A、B與蛋白質(zhì)C的相對分子質(zhì)量相差較大，可用凝膠過濾的方法將蛋白質(zhì)A、B與蛋白質(zhì)C分開并純化。又由于蛋白質(zhì)A與B等電點不同，可用離子交換層析將蛋白質(zhì)A與B分開并純化。7.有一蛋白質(zhì)，在某組織內(nèi)含量較低，很難分離純化，現(xiàn)已知其相對分子質(zhì)量，并已有該蛋白的抗體，問哪些試驗方法可以初步證實組織內(nèi)的確含有該蛋白質(zhì)？解答：先進行蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離組織蛋白，然后再進行蛋白質(zhì)印跡，最后用抗體酶聯(lián)檢測（即WesternBlotting方法）第九節(jié)蛋白質(zhì)的分類1.蛋白質(zhì)形狀球狀蛋白纖維狀蛋白2.分子組成

簡單蛋白（按溶解度）

結合蛋白（按輔基）清蛋白球蛋白谷蛋白醇溶蛋白精蛋白組蛋白硬蛋白核蛋白糖蛋白與蛋白聚糖脂蛋白色蛋白磷蛋白3.按蛋白質(zhì)的生物學功能分類（1）催化功能生物體內(nèi)的酶都是由蛋白質(zhì)構成的，沒有酶，生物體內(nèi)的各種化學反應就無法正常進行。（2）結構功能蛋白質(zhì)可以作為生物體的結構成分。高等動物的膠原蛋白是主要的細胞外結構蛋白，占蛋白總量的1/4；細胞膜、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜系統(tǒng)都是由蛋白質(zhì)與脂類組成的；動物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構成的。（3）運輸功能脊椎動物的血紅蛋白和無脊椎動物的血藍蛋白起著運輸氧氣的作用；血液中的載脂蛋白可運輸脂肪，轉(zhuǎn)鐵蛋白可轉(zhuǎn)運鐵；一些脂溶性激素的運輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結合球蛋白結合才能在血液中運輸。

（4）貯存功能