基因工程的載體

第三章基因工程的載體前言載體通論第一節(jié)質(zhì)粒載體第二節(jié)

λ噬菌體載體第三節(jié)單鏈絲狀噬菌體載體前言載體通論一、基本概念

利用重組DNA技術(shù)分離目的基因，稱之為基因克隆(genecloning)?？寺?clone)：作物動詞時是指從單一祖先產(chǎn)生同一的DNA分子群體或細(xì)胞群體的過程，作名詞時指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的特殊群體?；蛭膸?genelibrary)：由大量的含有基因組DNA的不同DNA片段的克隆所構(gòu)成的群體。載體(vector)：在基因工程中，攜帶著目的基因或DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具DNA分子。二、分類

克隆載體表達(dá)載體質(zhì)粒載體噬菌體載體人工染色體按載體功能分按載體性質(zhì)分表達(dá)體系載體宿主原核生物表達(dá)體系質(zhì)粒、噬菌體細(xì)菌酵母表達(dá)體系大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒酵母轉(zhuǎn)基因植物體系大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭載體（Ti質(zhì)粒）、病毒等植株哺乳細(xì)胞表達(dá)體系大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭載體（病毒）、脂質(zhì)體等培養(yǎng)動物細(xì)胞基因直接導(dǎo)入DNA本身（基因槍微粒轟擊法等）生殖細(xì)胞、體細(xì)胞、個體三、基因工程載體必須具備的條件：

※（1）有復(fù)制起點

※（2）具有若干個限制性內(nèi)切酶的單一識別位點

※（3）具備合適的篩選標(biāo)記

※（4）具備合適的拷貝數(shù)目（5）分子量要相對較?。?）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高（7）易分離純化※表示載體必須具備的條件第一節(jié)質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒(plasmid)的基本特性

Plasmid獨立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。質(zhì)粒DNA多呈超螺旋的共價閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircular,cccDNA)，大小為1-200kb，可以持續(xù)穩(wěn)定地處于游離狀態(tài)，但一定條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制。編碼抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細(xì)胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，因此應(yīng)用廣泛。1、質(zhì)粒的復(fù)制：由復(fù)制子(ori，復(fù)制起始區(qū)及與此相關(guān)的順式作用元件)決定。質(zhì)粒復(fù)制的機理請見教材。2、質(zhì)粒的拷貝數(shù)：根據(jù)每個寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個拷貝）。作為載體的質(zhì)粒一般應(yīng)該是松弛型的?？截悢?shù)是由復(fù)制起始點的類型決定的，如pMB1或ColE1。

pUC系列載體中的突變型pMB1復(fù)制子可達(dá)500-700個拷貝。3、質(zhì)粒的不親和性(incompatibility)：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。涉及細(xì)胞分裂過程中的競爭性選擇。不相容群。4、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：自然條件下質(zhì)?？赏ㄟ^細(xì)菌的接合(conjugation)的作用而轉(zhuǎn)移到新的宿主細(xì)胞中。三親雜交法。質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件：1有特定的復(fù)制起始子。2有多種限制性內(nèi)切酶切點，但每種切口最好只有1個；3有選擇標(biāo)記，例如抗藥性標(biāo)記，藍(lán)白斑試驗；4有一定容量；5有相當(dāng)?shù)目截悢?shù)，即每個宿主菌可能容納的最多數(shù)。2023/1/239二、標(biāo)記基因1、選擇標(biāo)記基因：用于鑒別目的DNA的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。Ampr（氨芐青霉素抗性基因）：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)。Tetr（四環(huán)素抗性基因）：阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。Cmr（氯霉素抗性基因）：編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Kanr（卡那霉素抗性基因）：編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶。supF（琥珀突變抑制基因）：編碼細(xì)菌抑制性tRNA，可翻譯UAG為酪氨酸。赭石突變（UAA），乳白突變（UGA）。正向選擇標(biāo)記：蔗糖致死基因sacB。2023/1/23102、篩選標(biāo)記基因：用于將重組子與非重子區(qū)別開來。α-互補(αcomplementation)：人工突變使大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)缺失N-端的第11-41位氨基酸，而載體則攜帶有LacZ基因的N-端140個氨基酸和編碼區(qū)段(lacZ’)，二者單獨存在時均無功能，但共存于一個大腸桿菌細(xì)胞時則發(fā)生功能互補，形成具有完全活性的LacZ酶。多克隆位點(multiplecloningsite)：載體上的一段人工設(shè)計和人工合成的DNA序列，含有多個在該載體唯一的限制性內(nèi)切酶的切點，以方便載體與外源片段的重組。插入失活(insretionalinactivation)：當(dāng)一段足夠長的外源DNA片段插入到一個功能基因的編碼區(qū)后，導(dǎo)致ORF移碼或提前終止，嚴(yán)重破壞原基因的編碼能力而使該基因失活。藍(lán)白斑篩選(white-bluescreening)：空載體轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，由于α-互補而形成的功能性的LacZ蛋白，能夠轉(zhuǎn)化無色底物X-gal而形成深藍(lán)色的產(chǎn)物，使菌落或噬菌斑顯藍(lán)色(藍(lán)斑)；重組載體的轉(zhuǎn)化子中，由于lacZ’基因的插入失活而不能形成α-互補，在IPTG+X-gal條件下菌落或噬菌斑不顯藍(lán)色(白斑)；通過菌落或噬菌斑的藍(lán)/白色差異而達(dá)到篩選鑒定出重組子與非重組子的目的。三、質(zhì)粒載體的種類質(zhì)粒的發(fā)展階段

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101、ColE1、pCR、pBR313和pBR322。

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

第三階段：完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3、T7、SP6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。1、克隆載體1）pBR322

pBR322為4.36kb的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應(yīng)用于基因工程的載體之一。把pBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，換上合用的表達(dá)組件，就可以構(gòu)建成工作所需的新載體。

許多實用的質(zhì)粒載體都是在pBR322的基礎(chǔ)上改建而成?？梢娖湓唾|(zhì)粒在使用上有優(yōu)點。有過百個限制性內(nèi)切酶切點，一種限制性內(nèi)切酶只有單一切口的位點也多達(dá)數(shù)十個，幾乎具備了所有常用限制酶都能切開并插入目的基因的優(yōu)越條件。有兩個抗藥性基因（Ampr和Tetr）.

此外，pBR322DNA被限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段大小均已知道，可以作為核酸電泳的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖插入失活法以pBR322為基礎(chǔ)的重組子篩選方法2）pUC18/pUC19質(zhì)粒系列

pUC質(zhì)粒系列是在pBR322基礎(chǔ)上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的Ampr基因和復(fù)制起始點。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ基因及其啟動子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker。

pUC18與pUC19只是多克隆位點的排列方向相反，其余一致。476bp片段含有E.coli的LacZ基因的5’序列，表達(dá)半乳糖苷酶的α片段。

LacZ的上游包括乳糖操縱子上的啟動子Plac和操縱基因O。

LacZ之內(nèi)是M13的克隆位點。三個顯著特點：（1）分子量更小，僅為2.7kB，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個細(xì)胞含500-700個拷貝）。（2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標(biāo)記基因LacZα，可利用α-互補原理進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。（3）多克隆位點區(qū)（multiplecloningsite,MCS）由人工合成的多個單一酶切位點構(gòu)成。其MCS區(qū)與M13mp噬菌體載體的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接轉(zhuǎn)移到M13mp載體，進(jìn)行DNA測序和體外突變等研究。2023/1/23213）pUC118/pUC119質(zhì)粒系列在pUC18/pUC19質(zhì)?；A(chǔ)上，增加了帶有M13噬菌體DNA合成的起始和終止以及包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的順式序列，也稱為噬菌粒。4）pGEM-3Z/4Z質(zhì)粒系列在pUC18/pUC19質(zhì)粒基礎(chǔ)上，在多克隆位點兩端添加了噬菌體的轉(zhuǎn)錄啟動子，可用于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。5）多功能質(zhì)粒載體典型的為pBluescriptⅡKS(±)、pBluescriptⅡSK(±)，具有多克隆位點、α-互補、噬菌體啟動子、單鏈?zhǔn)审w的復(fù)制與包裝信號等。K=KpnⅠ，S=SacⅠ2023/1/23222、表達(dá)載體一般是在克隆的載體上添加和完善了用于外源基因表達(dá)的一些基本元件，如強啟動子、蛋白純化標(biāo)簽、信號肽、誘導(dǎo)表達(dá)元件等。如Novagen的pET系列、Qiagen的pQE系列。以后有詳講解。第二節(jié)

λ噬菌體載體一、λ噬菌體的分子生物學(xué)λ噬菌體的組成結(jié)構(gòu)和用途噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。λ噬菌體為線性雙鏈DNA的細(xì)菌病毒，具有互補的12bp粘性末端，感染細(xì)菌后粘端互補成雙鏈環(huán)狀。全長48531bp，含50多個基因。λ噬菌體基因大致分為4個區(qū)：結(jié)構(gòu)區(qū)：A～J19個基因，編碼頭、尾部蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)區(qū)。組區(qū)att(attachment)、int(intagrate)及xis(excission)。調(diào)控區(qū)啟動子、終止子和N、CI基因。裂解區(qū)：Q-R。2023/1/2326λ噬菌體可以容納較大的目的基因。例如用置換法可去掉長達(dá)20kb的λDNA，換入相應(yīng)長度的目的基因?；蛭膸鞓?gòu)建常使用λ載體。不少先進(jìn)的質(zhì)粒應(yīng)用λ組件進(jìn)行構(gòu)建。二、λ載體的選擇標(biāo)記1、基因組大?。涸蚪M的75-105%大小時可以包裝，否則不能包裝。2、LacZ基因：象質(zhì)粒一樣進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。3、cⅠ基因失活：該基因表達(dá)時促進(jìn)進(jìn)入溶原狀態(tài)，該基因失活后促進(jìn)進(jìn)入裂解狀態(tài)。三、代表性的λ載體1、插入型λ載體：如λgt10、λgt11、Λgem-2/4、λZAPⅡ、λExCell等，一般采用單一切點將λ切開，插入外源DNA，容量只有0-11kb，主要用于cDNA文庫構(gòu)建、表達(dá)融合蛋白、合成探針等。2、置換型λ載體：λ的中間裂解生長的非必須區(qū)段可以用外源DNA替代，形成填充區(qū)段，因此允許的外源DNA可達(dá)到9-23kb，代表性載體有EMBL3/4、λ2001、λDASH、λFIX、λGEM-11等，主要用于構(gòu)建基因組DNA文庫。2023/1/2328四、λ載體的克隆原理和步驟1、通過裂解過程增殖λ載體。2、載體與外源DNA的酶切。載體一般要純化左路、右臂，并進(jìn)行去磷酸化處理。3、外源DNA與載體的連接，形成的是多聯(lián)體。4、重組噬菌體的體外包裝，需要單獨制備衣殼蛋白，包裝過程對DNA大小有選擇性。5、包裝后的噬菌體顆粒感染大腸桿菌，經(jīng)過λ的復(fù)制、包裝和裂解過程，重組載體得到擴(kuò)增，一個λ的感染和擴(kuò)增會導(dǎo)致它周圍一圈范圍內(nèi)的大腸桿菌被溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑(plaque)。6、篩選。每個噬菌斑代表了一個重組λ，所有噬菌斑的集合就為一個文庫。pfu:plaqueformingunit，噬菌斑形成單位，指每微克包裝λDNA感染大腸桿菌后形成的噬菌斑數(shù)，要求100萬以上。2023/1/2329第三節(jié)單鏈絲狀噬菌體載體一、M13噬菌體載體

M13噬菌體屬絲狀噬菌體，其基因組為閉合環(huán)狀正鏈ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都編碼蛋白質(zhì)，有10個基因，有兩個較長的間隔區(qū)，是外源基因插入的部位。M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機制。1、以(+)鏈DNA為摸板，合成互補(－)鏈，該雙鏈稱復(fù)制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，達(dá)每個細(xì)胞約200個拷貝。3、單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在(+)鏈上，從而阻斷了其互補鏈，即(－)鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會不斷的合成(+)鏈DNA。20