外源基因表達(dá)系統(tǒng)張幻燈片

外源基因表達(dá)系統(tǒng)張幻燈片第一頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/291

基因工程所用的宿主菌,皆經(jīng)過人工改造原因是野生型細(xì)菌具有針對外源DNA的限制和修飾系統(tǒng),會(huì)切割未經(jīng)修飾的外源DNA.經(jīng)過改造的宿主菌一般具備下列特點(diǎn)限制系統(tǒng)缺陷型:不切割外源DNA.

重組缺陷型:避免外源DNA與宿主DNA的重組.

轉(zhuǎn)化親和型:改變細(xì)胞壁的通透性,提高轉(zhuǎn)化效率.

第二頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/292第一節(jié)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)一.大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)：外源基因可以高水平表達(dá)培養(yǎng)方便、價(jià)廉、可大規(guī)模生產(chǎn)生物學(xué)、遺傳學(xué)背景清楚安全性好寄主菌株及載體較多第三頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/293大腸桿菌第四頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/294二.大腸桿菌的表達(dá)條件克隆的真核基因必須連續(xù)，無內(nèi)含子序列。大腸桿菌不能識別真核啟動(dòng)子，外源基因須置于原核啟動(dòng)子的控制之下。常用的啟動(dòng)子有Lac、trp、tac、T7、λPL等。強(qiáng)啟動(dòng)子外源蛋白質(zhì)的表達(dá)占菌體總蛋 白質(zhì)的10-30％。第五頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/295啟動(dòng)子有關(guān)知識大腸桿菌的啟動(dòng)子是控制外源基因轉(zhuǎn)錄的重要元件，基因表達(dá)程度與啟動(dòng)子的強(qiáng)弱密切相關(guān)。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱主要取決于啟動(dòng)子本身的序列，尤其是－10區(qū)(TATAA)和－35區(qū)(TTGACA)的組成。在真核基因中發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow框的共同序列，即位于—25～—30bp處的TATAAAAG，也稱TATA框(TATAbox)。

第六頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/296常用的大腸桿菌啟動(dòng)子Plac

來源于乳糖操縱子Ptrp

來源于色氨酸操縱子PL

來源于λ噬菌體早期操縱子PrecA

來源于recA基因第七頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/297啟動(dòng)子的可控性

目前使用的大腸桿菌啟動(dòng)子，一般含有與阻遏蛋白特異性結(jié)合的序列，因此由這些啟動(dòng)子介導(dǎo)的外源基因在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)通常是痕量表達(dá)的。例如在不含乳糖的培養(yǎng)基內(nèi)，Plac啟動(dòng)子處于阻遏狀態(tài)，外源基因極少表達(dá)。第八頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/298當(dāng)重組大腸桿菌生長到某一階段，向培養(yǎng)物中加入乳糖或IPTG（異丙基硫代半乳糖苷

isopropylthiogalactoside，IPTG),它們特異性的與阻遏蛋白結(jié)合，使之從操縱子上脫落下來，啟動(dòng)子打開并啟動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄。（化學(xué)誘導(dǎo)）第九頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/299溫度誘導(dǎo)PL啟動(dòng)子將工程菌先置于300Ｃ進(jìn)行培養(yǎng)，在此溫度范圍內(nèi)，由大腸桿菌合成的CI857阻遏蛋白與PL

的操縱子區(qū)域結(jié)合，關(guān)閉外源基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)工程菌培養(yǎng)到合適的生長階段，（一般為對數(shù)生長中期）時(shí)，迅速將培養(yǎng)溫度提高到420Ｃ，此時(shí)CI857失活，從操縱子上脫落下來，PL啟動(dòng)子遂啟動(dòng)外源基因轉(zhuǎn)錄。第十頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2910

化學(xué)誘導(dǎo)與溫度誘導(dǎo)在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模比較容易做到，（發(fā)酵罐1～5升）。但在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)（發(fā)酵罐數(shù)十升～數(shù)百升乃至數(shù)千升），生產(chǎn)成本很高。第十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2911

為解決此問題，可對工程菌進(jìn)行改造。

例如：采用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)將CI857阻遏蛋白編碼基因置于Ptrp啟動(dòng)子之下，克隆在一個(gè)低表達(dá)質(zhì)粒上，從而保證阻遏蛋白表達(dá)較低；第二個(gè)重組質(zhì)粒則含有PL啟動(dòng)子控制的目的基因。當(dāng)培養(yǎng)基中缺少色氨酸時(shí)，Ptrp打開，CI857

阻遏蛋白生成，由PL介導(dǎo)的目的基因不表達(dá)；相反，當(dāng)色氨酸大量存在時(shí)，Ptrp啟動(dòng)子關(guān)閉，CI阻遏蛋白不再生成，PL開放。第十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2912

此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物組成的廉價(jià)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，內(nèi)含微量的色氨酸，欲使外源基因表達(dá)時(shí)，可加入富含色氨酸的胰蛋白胨進(jìn)行誘導(dǎo)。第十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2913原核表達(dá)存在的問題 翻譯后的加工修飾

真核細(xì)胞的某些蛋白質(zhì)翻譯合成后，還需要加工和修飾，如糖基化，但大腸桿菌細(xì)胞無此功能。 細(xì)菌蛋白酶的存在

細(xì)菌蛋白酶對外源蛋白質(zhì)的切割第十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2914真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的部位1.表達(dá)產(chǎn)物存在的部位①細(xì)胞質(zhì)；②細(xì)胞周質(zhì)；③分泌到細(xì)胞外①細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)： 包涵體（inclusionbody):細(xì)胞質(zhì)中不溶性的蛋白質(zhì)聚集形成的顆粒。第十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2915優(yōu)點(diǎn)： 形成包涵體，易于純化分離，抵抗細(xì)菌蛋白酶的水解；對寄主無毒害蛋白質(zhì)產(chǎn)量高表達(dá)載體構(gòu)建比較簡單第十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2916缺點(diǎn)：形成包涵體的外源蛋白質(zhì)，一般沒有生物活性?；謴?fù)生物學(xué)活性的過程，有時(shí)非常困難?；钚缘鞍踪|(zhì)的終產(chǎn)量低。細(xì)胞質(zhì)還原的環(huán)境不利于形成二硫鍵N-末端存在甲硫氨酸，蛋白質(zhì)真實(shí)性受影響蛋白質(zhì)種類多，純化工作量比較大。第十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2917②周質(zhì)中表達(dá)周質(zhì)（periplasm)—大腸桿菌一類格蘭氏陰性細(xì)菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白，借助信號肽穿過細(xì)胞內(nèi)膜到達(dá)周質(zhì)第十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2918優(yōu)點(diǎn)：蛋白種類少，易純化酶解程度低促進(jìn)二硫鍵的形成和蛋白質(zhì)的折疊蛋白質(zhì)N-端真實(shí)性缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)運(yùn)的效率不穩(wěn)定第十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2919③表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞分泌外源蛋白質(zhì)利用信號肽；融合蛋白配體；透化劑；第二十頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2920蛋白質(zhì)合成后需要經(jīng)過復(fù)雜機(jī)制，定向輸送到最終發(fā)揮生物功能的細(xì)胞靶部位，這一過程稱為蛋白質(zhì)的靶向輸送。

蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送?蛋白質(zhì)的靶向輸送(proteintargeting)第二十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號，主要為N末端特異氨基酸序列，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的適當(dāng)靶部位，這一序列稱為信號序列。

?信號序列(signalsequence)第二十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日常見的信號序列由10～40個(gè)氨基酸殘基組成，N端為帶正電荷的氨基酸殘基，中間為疏水的核心區(qū)，而C端由小分子氨基酸殘基組成（加工區(qū)），可被信號肽酶識別并裂解。

第二十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日信號假說：分泌型蛋白質(zhì)的定向輸送，就是靠信號肽與胞漿中的信號肽識別粒子（SRP）識別并特異結(jié)合，然后再通過SRP與膜上的對接蛋白（DP，即SRP受體）結(jié)合后→開放膜蛋白通道→分泌性蛋白穿過膜→膜外側(cè)面信號肽酶切斷信號肽加工區(qū)。第二十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日信號肽的一級結(jié)構(gòu)第二十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：酶解作用低純化方便增進(jìn)蛋白折疊N-端的結(jié)構(gòu)真實(shí)第二十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2926分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因即便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多。第二十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2927短小芽孢桿菌表達(dá)蛋白質(zhì)例1：表達(dá)白細(xì)胞介素－2，表達(dá)產(chǎn)物無需復(fù)性處理，即具有生物活性。產(chǎn)率達(dá)50mg/L。例2：表達(dá)人表皮生長因子（EGF），產(chǎn)率達(dá)1g/L以上。澳大利亞盛產(chǎn)羊毛，每年需要大批的剪羊毛的技工，由于EGF可引起羊毛從根部自行脫落，故每只羊注射5mgEGF，在1月后可用手直接抓下羊毛。第二十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2928利用梭菌屬嗜熱菌株

由纖維素生產(chǎn)乙醇纖維素是由葡萄糖單體以β－1，4－糖苷鍵連接的多糖，利用梭菌屬嗜熱菌株可由纖維素直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。利用基因工程技術(shù)改造菌株，增加乙醇的產(chǎn)率，降低副產(chǎn)物（如乙酸、丁酸等）。第二十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2929第二節(jié)酵母菌表達(dá)體系第三十頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2930酵母菌的種類酵母菌（Yeast）有56個(gè)屬500多個(gè)種組成。如果說大腸桿菌是最成熟的原核表達(dá)系統(tǒng)，則酵母菌是最成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)。常用的有：酵母屬（如釀酒酵母）畢赤酵母屬（如巴斯德畢赤酵母屬）裂殖酵母屬（如非洲酒裂殖酵母）第三十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2931一.啤酒酵母啤酒酵母又名面包酵母，被稱為真核生物中的“大腸桿菌”。易于培養(yǎng)其單倍體核酸DNA容量為大腸桿菌基因組的3.5倍第三十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2932啤酒酵母特點(diǎn)培養(yǎng)簡單,經(jīng)濟(jì),快捷適于有氧和無氧條件下的大規(guī)模培養(yǎng)單倍體酵母細(xì)胞含有15Mb的基因組,16條大小約200-2200Kb的線性染色體。（培養(yǎng)室內(nèi)空氣可聞）第三十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2933二.甲醇酵母表達(dá)體系第三十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/29341.甲醇酵母的生物學(xué)特點(diǎn)甲醇酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母.在缺乏碳源如葡萄糖\甘油時(shí),能利用甲醇作為唯一的碳源;生長溫度28-30C。如巴斯德畢赤酵母就是常用的表達(dá)系統(tǒng)。第三十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/29352.甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)具有強(qiáng)有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，從而表達(dá)出有生物活性的外源蛋白營養(yǎng)要求低，生長快，培養(yǎng)基廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn)可高密度發(fā)酵培養(yǎng).第三十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2936表達(dá)量高，數(shù)百mg/L以上水平表達(dá)的蛋白既可存在于細(xì)胞，又可分泌到胞外。由于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背景蛋白）非常少，十分有利于純化。糖基化程度低。第三十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2937多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)已用于表達(dá)乙肝表面抗原第三十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/29383.應(yīng)用舉例

畢赤酵母牛溶菌酶；乙肝表面抗原；人腫瘤壞死因子；人表皮生長因子；人組織纖溶酶原活化劑；鏈激酶；破傷風(fēng)毒素片段C；第三十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2939乳酸克魯維酵母牛凝乳酶；人白細(xì)胞介素1β；

α－半乳糖苷酶多型漢遜酵母乙肝表面抗原

α－半乳糖苷酶葡萄糖淀粉酶第四十頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2940第三節(jié)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

昆蟲屬于動(dòng)物界節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱，其發(fā)育過程以變態(tài)而著稱。昆蟲是地球上分布最廣、數(shù)量最多的動(dòng)物，有上百萬種。用于表達(dá)外源基因的多為家蠶系統(tǒng)。第四十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2941昆蟲表達(dá)系統(tǒng)

昆蟲是高等真核生物,能進(jìn)行翻譯后加工和修飾.昆蟲細(xì)胞常用于真核蛋白質(zhì)的生產(chǎn).其生長速度快,不需要CO2培養(yǎng)箱,易于懸浮培養(yǎng),可用于大規(guī)模表達(dá)蛋白質(zhì).

第四十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2942家蠶表達(dá)系統(tǒng)家蠶屬于鱗翅目家蠶科，人類飼養(yǎng)家蠶已有5000余年歷史。我國是家蠶業(yè)的發(fā)祥地，自古以來農(nóng)桑并茂，絲綢之路名揚(yáng)天下。我國的生絲產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70％，絲綢業(yè)的年產(chǎn)值達(dá)700億元。

第四十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2943

我國科學(xué)家于2003年率先完成家蠶基因組框架圖，覆蓋率和精確度分別達(dá)到95.54和99.95，是我國科學(xué)家向人類社會(huì)貢獻(xiàn)的第三大基因組研究成果。第四十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2944家蠶的特點(diǎn)是絲素蛋白的高效表達(dá)。蠶絲的主要成分是絲素蛋白。在家蠶的絲素蛋白合成期，每個(gè)細(xì)胞每秒合成數(shù)萬個(gè)絲素分子。第四十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2945桿狀病毒載體桿狀病毒是含有包膜的雙鏈DNA病毒，宿主為無脊椎動(dòng)物。主要感染昆蟲，包括鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、毛翅目等。桿狀病毒表達(dá)載體可分為兩大類：

1.表達(dá)單個(gè)外源基因

2.表達(dá)多個(gè)外源基因第四十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2946桿狀病毒載體的構(gòu)建以pUC質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建，提供Amp抗性；多角體蛋白編碼基因的啟動(dòng)子；多克隆位點(diǎn)位于該啟動(dòng)子的下游；家蠶絲心蛋白編碼基因啟動(dòng)子：被認(rèn)為是自然界最強(qiáng)的啟動(dòng)子，但由其介導(dǎo)的外源基因高效表達(dá)對宿主細(xì)胞的生理過程有干擾。第四十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2947二.昆蟲細(xì)胞宿主常用的宿主為sf9和sf21。 來源于草地夜蛾的卵巢細(xì)胞。第四十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2948第四節(jié)哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

優(yōu)點(diǎn)：哺乳動(dòng)物細(xì)胞可加工修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括二硫鍵的形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成、蛋白酶的定點(diǎn)切割產(chǎn)生具有天然活性的蛋白質(zhì)缺點(diǎn)：細(xì)胞生長緩慢，培養(yǎng)周期長；

生產(chǎn)成本高；第四十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/29492．蛋白質(zhì)切割末端切割膜蛋白、分泌蛋白：在氨基端具有一段信號肽。信號肽必須切除多肽鏈才具有功能。脊椎動(dòng)物前胰島素原長105aa，首先切除氨基端的24aa，成為前體胰島素再將中間的一段切除，留下兩端有活性的部分，即21aa酸殘基的A鏈和30aa的B鏈兩條鏈由兩個(gè)二硫鍵連接成有生物活性的胰島素。第五十頁，共六十八頁，2022年，8月28日3、蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾簡單的化學(xué)修飾：將乙?；?、甲基、磷酸基、羥基等小基團(tuán)加到氨基酸側(cè)鏈上，或者加到氨基端或羧基端不同蛋白質(zhì)可以有完全相同的修飾相同的蛋白質(zhì)可以有完全不同的修飾磷酸化在基因表達(dá)中具有重要的調(diào)控作用第五十一頁，共六十八頁，2022年，8月28日復(fù)雜的修飾糖基化（glycosylation），將不同的碳水化合物（糖類）加到多肽鏈上。第五十二頁，共六十八頁，2022年，8月28日人類的ABO血型控制ABO血型的是一個(gè)復(fù)等位基因座位，編碼負(fù)責(zé)將糖基加到紅細(xì)胞膜上的糖蛋白分子上的酶。三個(gè)等位基因，編碼三個(gè)不同的酶將N－乙酰－半乳糖胺（N－acety－galactosamine）加到糖蛋白上，A血型將半乳糖（galactose）加到糖蛋白上，B血型第三個(gè)基因編碼的酶無功能，不能將任何糖加到糖蛋白上，O血型第五十三頁，共六十八頁，2022年，8月28日常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)細(xì)胞CHO細(xì)胞中國倉鼠卵巢上皮細(xì)胞，是一株缺乏二氫葉酸還原酶的營養(yǎng)缺陷突變株。表達(dá)量可達(dá)10mg/L，可大規(guī)模培養(yǎng)（數(shù)千升）。已表達(dá)的產(chǎn)物有組織纖溶酶原激活劑（tPA）、凝血因子ⅤⅢ、紅細(xì)胞生成素等。第五十四頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2954COS細(xì)胞來源于非洲綠猴腎細(xì)胞系（CV－1），屬于瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞。即由于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第五十五頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2955從2000年以后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更受重視。目前，美國418種在研藥物中約70%是以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的。在FDA已批準(zhǔn)上市的生物技術(shù)藥物中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品占70%以上。第五十六頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2956一.用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的載體病毒載體：（1）含有能夠被真核細(xì)胞識別的有效啟 動(dòng)子（2）在感染周期中能夠持續(xù)復(fù)制，達(dá)到很 高的拷貝數(shù)。（3）控制自己復(fù)制的元件（4）有些載體可高效穩(wěn)定地整合到寄主基 因組上（5）外殼蛋白識別細(xì)胞受體，可將外源基 因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。第五十七頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/29571.SV40病毒載體SV40：猿猴空泡病毒（Simianvacuolatingvirus40,SV40)

環(huán)型雙鏈DNA分子，含5243bp。第五十八頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2958重組的病毒-質(zhì)粒載體含有完整的早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)的病毒-質(zhì)粒載體：病毒的早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)+大腸桿菌的質(zhì)粒分子重組而成。例如：pC10＝早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)（多瘤病毒）＋質(zhì)粒pBR322

這種載體既可在大腸桿菌中復(fù)制，也可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，稱之為穿梭載體。第五十九頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/29592.反轉(zhuǎn)錄病毒載體宿主范圍廣，感染動(dòng)物或人的細(xì)胞。具有強(qiáng)啟動(dòng)子不引起宿主細(xì)胞的死亡，可以維持許多代第六十頁，共六十八頁，2022年，8月28日2023/1/2960第四節(jié)

外源基因?qū)胨拗?/p>

細(xì)胞的物理化學(xué)方法

參見教材第六章P121