基因工程的基本操作程序課件 【備課精講精研】 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序PCR擴(kuò)增儀

1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么嗎？

從社會(huì)中來(lái)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉(使棉鈴蟲(chóng)死亡，左)與非轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉(右)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：提取棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。前提核心關(guān)鍵保證01基因工程的基本操作程序①定義：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀的或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。目的基因受體細(xì)胞目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因一.目的基因的篩選與獲取1.目的基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子：RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)（1）原核生物基因終止子：終止轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū)

組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游

功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)啟動(dòng)子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)終止子：終止RNA的合成編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成2.基因的結(jié)構(gòu)一.目的基因的篩選與獲取非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345加工mRNA前體成熟mRNA不能編碼蛋白質(zhì)的序列=內(nèi)含子+非編碼區(qū)序列12345啟動(dòng)子終止子一.目的基因的篩選與獲?。?）真核生物基因轉(zhuǎn)錄2.基因的結(jié)構(gòu)編碼序列=外顯子轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉目的基因——Bt基因蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生Bt基因伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲(chóng)蛋白)表達(dá)破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)殺死棉鈴蟲(chóng)棉花細(xì)胞導(dǎo)入抗蟲(chóng)棉培育一.目的基因的篩選與獲取基因海洋目的基因如何篩選相關(guān)的已經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因篩選①篩選方法之一一.目的基因的篩選與獲取3.篩選合適目的基因蘇云金桿菌制成殺蟲(chóng)劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲(chóng)蛋白)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因。②Bt基因的篩選一.目的基因的篩選與獲取3.篩選合適目的基因測(cè)序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(如GenBank)序列比對(duì)工具(如BLAST)測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)序列以堿基順序或氨基酸殘基順序?yàn)榛緝?nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的工具。通過(guò)比對(duì)識(shí)別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能。③篩選目的基因的技術(shù)手段一.目的基因的篩選與獲取3.篩選合適目的基因目的基因獲取方法一.目的基因的篩選與獲取4.目的基因的篩選與獲取方法人工合成目的基因的核苷酸序列已知利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因從基因文庫(kù)中獲取①PCR的含義PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)。根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制。②PCR的原理常用方法目的基因的核苷酸序列未知PCR技術(shù)：PCR是______________

_的縮寫(xiě)，是一項(xiàng)根據(jù)___________的原理，在___

_提供參與DNA復(fù)制的___

____與__

_______，對(duì)___________________

_進(jìn)行______

__的技術(shù)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因一.目的基因的篩選與獲取4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因原理操作環(huán)境目的優(yōu)點(diǎn)：①DNA復(fù)制所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開(kāi)DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）（2種）引物是一小段能與__________的一段堿基序列__________的____________DNA母鏈互補(bǔ)配對(duì)短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物一.目的基因的篩選與獲取4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因子鏈延伸子鏈延伸耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）②PCR條件:一.目的基因的篩選與獲取四種脫氧核苷酸激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性

當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈③PCR反應(yīng)過(guò)程3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’一.目的基因的篩選與獲取4.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物③PCR反應(yīng)過(guò)程一.目的基因的篩選與獲取一.目的基因的篩選與獲?、跴CR反應(yīng)過(guò)程比較項(xiàng)目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化邊解旋邊復(fù)制DNA在高溫下變性解旋全部解旋后在復(fù)制場(chǎng)所主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外(主要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高溫的DNA聚合酶溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進(jìn)行結(jié)果合成整個(gè)DNA分子擴(kuò)增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3‘端合成子鏈

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。①基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因。②部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)。（1）基因文庫(kù)類(lèi)型：一.目的基因的篩選與獲?、軜?gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因（1）基因文庫(kù)類(lèi)型：提取某種生物的全部DNA許多一定大小的DNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袑NA片段與載體連接基因組文庫(kù)①基因組文庫(kù)的構(gòu)建模式圖某種生物特定發(fā)育時(shí)期的mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈DNA片段

反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶cDNA文庫(kù)成熟mRNA與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存（1）基因文庫(kù)類(lèi)型：②部分基因文庫(kù)的構(gòu)建模式圖基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較

文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)

基因組文庫(kù)

文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以①

;②

。二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.目的使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用——核心步驟2.組成

當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。（1）啟動(dòng)子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的____片段。DNA①本質(zhì)：②位置：位于基因的____，緊挨____________。上游轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：（啟動(dòng)子≠起始密碼）終止子啟動(dòng)子目的基因標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)基因表達(dá)載體（2）終止子：①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的____片段。DNA②位置：位于基因的_____。下游③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)。（3）標(biāo)記基因：①作用：便于重組DNA分子的篩選。（4）目的基因：②常見(jiàn)類(lèi)型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。如Bt基因,能控制表達(dá)所需要的特殊性狀。（5）復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)。注意：目的基因必須插入到

與

之間。啟動(dòng)子終止子（終止子≠終止密碼）二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建2.組成辨析：“啟動(dòng)子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”啟動(dòng)子與終止子位于DNA分子中，作用：起始和終止轉(zhuǎn)錄過(guò)程。起始密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，作用：起始和終止翻譯過(guò)程。二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建【思考1】重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因DNA連接酶基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.過(guò)程啟動(dòng)子首端RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止子尾端RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄標(biāo)記目的基因基因表達(dá)載體的組成：二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建【小結(jié)】第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因表達(dá)載體受體細(xì)胞導(dǎo)入轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。動(dòng)物植物微生物（一）導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法(常用)

①導(dǎo)入方法1.花粉管通道法：我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)②受體細(xì)胞：體細(xì)胞子房花粉柱頭花粉管精子卵細(xì)胞胚囊三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中花粉管通道法子房注射花柱滴加在植物授粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ǖ倪^(guò)程：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞萌發(fā)的花粉管花柱子房胚囊卵細(xì)胞方法1花粉管通道法優(yōu)點(diǎn)柱頭①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進(jìn)入胚囊，此時(shí)的受精卵未形成細(xì)胞壁，且正在進(jìn)行活躍的DNA復(fù)制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。②操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成本低，免去了組織培養(yǎng)以及誘導(dǎo)再生植株的全套人工培養(yǎng)過(guò)程。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染___________和_________，而對(duì)大多數(shù)___________沒(méi)有侵染能力；雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有______，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將______上的______（___________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其_________________________；Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細(xì)胞的染色體DNA上

將目的基因插入_____________中，通過(guò)農(nóng)桿菌的_____作用，就可以使目的基因___________②利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）Ti質(zhì)粒T-DNA農(nóng)桿菌③農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過(guò)程：T-DNA目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養(yǎng)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞兩次拼接：第一次拼接是第二次拼接(非人工操作)指兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將第二次導(dǎo)入(非人工操作)是提醒：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接、兩次導(dǎo)入三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

④轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片_______________，然后_____________，并__________；與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株b.可以將____直接浸沒(méi)在________________中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得____，再進(jìn)行_____、_____等；花序含有農(nóng)桿菌的溶液種子篩選鑒定三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得成功?！@微注射法1.受體細(xì)胞：受精卵(因?yàn)槭芫讶菀妆憩F(xiàn)出全能性)2.過(guò)程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物（二）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——Ca2+處理法1.受體細(xì)胞：

常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最廣泛。2.原核生物的優(yōu)點(diǎn):

繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、易于培養(yǎng)。3.一般過(guò)程:Ca2+處理大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中（Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性）（感受態(tài)細(xì)胞）（三）導(dǎo)入微生物細(xì)胞Ca2+感受態(tài)細(xì)胞吸收三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞實(shí)例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物注意：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒(méi)有生物活性（無(wú)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工），需要在體外進(jìn)行再加工。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞種類(lèi)項(xiàng)目植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞DNA中→表達(dá)目的基因表達(dá)載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子【小結(jié)】三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性；2.檢測(cè)內(nèi)容及方法:四.目的基因的檢查與鑒定1.目的:（一）分子水平的檢測(cè)①檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入如：檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測(cè)Bt基因——通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)提取棉花細(xì)胞DNA用與Bt基因相關(guān)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)四.目的基因的檢查與鑒定②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄如：檢測(cè)Bt基因是否翻譯出mRNA提取棉花細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)用與Bt基因相關(guān)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增——通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)（一）分子水平的檢測(cè)③檢測(cè)目的基因是否翻譯如：檢測(cè)Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲(chóng)蛋白從棉花中提取蛋白質(zhì)用相應(yīng)抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交檢測(cè)——通過(guò)抗原-抗體雜交檢測(cè)檢測(cè)目的基因是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀如：檢測(cè)抗蟲(chóng)棉是否具有抗蟲(chóng)性狀采摘抗蟲(chóng)棉葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)觀察棉鈴蟲(chóng)存活情況四.目的基因的檢查與鑒定（二）個(gè)體水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定具體方法舉例轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲(chóng)植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲(chóng)（抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)）害蟲(chóng)死亡病毒（菌）接種實(shí)驗(yàn)未染病鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常四.目的基因的檢查與鑒定篩選和獲取目的基因獲取質(zhì)粒、噬菌體等載體構(gòu)建基因表達(dá)載體將含有目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞檢測(cè)和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性基因工程的基本操作流程圖篩選和獲取目的基因1.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因2.人工合成目的基因3.通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因第一步：目的基因的篩選與獲取構(gòu)建基因表達(dá)載體1.用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段2.用DNA連接酶連接第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建將含有目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞1.導(dǎo)入植物細(xì)胞：花粉管通道法；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射法3.導(dǎo)入原核細(xì)胞：用Ca2+處理受體細(xì)胞第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞檢測(cè)和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性1.分子水平檢測(cè)①檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入（PCR等技術(shù)檢測(cè)）②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄（PCR等技術(shù)檢測(cè)）③檢測(cè)目的基因是否翻譯（抗原-抗體檢測(cè)）2.個(gè)體水平檢測(cè)第四步：目的基因的檢測(cè)與鑒定探究?實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理（1）利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通過(guò)_________來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠________________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；熱變性調(diào)節(jié)溫度自動(dòng)調(diào)控溫度30②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了_________________的原理；DNA半保留復(fù)制基因工程的基本操作程序（2）DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在_____的作用下，這些________會(huì)向著__________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是_____；可解離的基團(tuán)pH電場(chǎng)帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)_______________來(lái)鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、________________和_____等有關(guān)（遷移速率與之呈負(fù)相關(guān)）④凝膠中的DNA分子通過(guò)_____，可以在波長(zhǎng)為_(kāi)_______的______下被檢測(cè)出來(lái)。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象基因工程的基本操作程序2.材料用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）基因工程的基本操作程序10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無(wú)菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等基因工程的基本操作程序3.方法步驟基因工程的基本操作程序PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL總體積50μL注：模板DNA的用量為1gp～1μg①移液：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量離心管中依次加入各組分（1）DNA片段的擴(kuò)增3.方法步驟基因工程的基本操作程序循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。③反應(yīng)：參照上表的參數(shù)，設(shè)