基因工程的基本操作程序課件 【備課精講精研】 高二下學期生物人教版選擇性必修3

第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序PCR擴增儀

1997年，我國政府首次批準商業(yè)化種植轉基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉基因抗蟲棉新品種100多個，減少農藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。你知道轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？

從社會中來轉基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左)與非轉基因抗蟲棉(右)培育轉基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？培育轉基因抗蟲棉的簡要過程：提取棉花細胞(含抗蟲基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因與運載體DNA拼接導入普通棉花(無抗蟲特性)棉花植株(有抗蟲特性)目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用。載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。前提核心關鍵保證01基因工程的基本操作程序①定義：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀的或獲得預期表達產(chǎn)物的基因。目的基因受體細胞目的基因主要是指編碼蛋白質的基因抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因一.目的基因的篩選與獲取1.目的基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子：RNA聚合酶的識別和結合位點開始轉錄編碼區(qū)（1）原核生物基因終止子：終止轉錄非編碼區(qū)

組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游

功能：不能編碼蛋白質，調控遺傳信息的表達啟動子：RNA聚合酶結合位點轉錄起始的信號終止子：終止RNA的合成編碼區(qū)：編碼蛋白質的合成2.基因的結構一.目的基因的篩選與獲取非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結合位點外顯子內含子12345加工mRNA前體成熟mRNA不能編碼蛋白質的序列=內含子+非編碼區(qū)序列12345啟動子終止子一.目的基因的篩選與獲?。?）真核生物基因轉錄2.基因的結構編碼序列=外顯子轉基因抗蟲棉目的基因——Bt基因蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生Bt基因伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)表達破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)殺死棉鈴蟲棉花細胞導入抗蟲棉培育一.目的基因的篩選與獲取基因海洋目的基因如何篩選相關的已經(jīng)結構和功能清晰的基因篩選①篩選方法之一一.目的基因的篩選與獲取3.篩選合適目的基因蘇云金桿菌制成殺蟲劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結構防治棉花害蟲發(fā)現(xiàn)殺蟲作用與Bt基因有關掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達產(chǎn)物(Bt抗蟲蛋白)Bt基因是培育轉基因抗蟲棉較為合適的目的基因。②Bt基因的篩選一.目的基因的篩選與獲取3.篩選合適目的基因測序技術序列數(shù)據(jù)庫(如GenBank)序列比對工具(如BLAST)測定核酸和蛋白質序列以堿基順序或氨基酸殘基順序為基本內容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進行比較的工具。通過比對識別相關的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質的功能。③篩選目的基因的技術手段一.目的基因的篩選與獲取3.篩選合適目的基因目的基因獲取方法一.目的基因的篩選與獲取4.目的基因的篩選與獲取方法人工合成目的基因的核苷酸序列已知利用PCR獲取和擴增目的基因從基因文庫中獲?、貾CR的含義PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制。②PCR的原理常用方法目的基因的核苷酸序列未知PCR技術：PCR是______________

_的縮寫，是一項根據(jù)___________的原理，在___

_提供參與DNA復制的___

____與__

_______，對___________________

_進行______

__的技術；聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外各種組分反應條件目的基因的核苷酸序列大量復制全稱聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復制可以在短時間內大量擴增目的基因一.目的基因的篩選與獲取4.利用PCR獲取和擴增目的基因原理操作環(huán)境目的優(yōu)點：①DNA復制所需的基本條件:參與的組分在DNA復制中的作用

解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶）（體外用高溫代替）（2種）引物是一小段能與__________的一段堿基序列__________的____________DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物一.目的基因的篩選與獲取4.利用PCR獲取和擴增目的基因子鏈延伸子鏈延伸耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）②PCR條件:一.目的基因的篩選與獲取四種脫氧核苷酸激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶4.利用PCR獲取和擴增目的基因3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性

當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復性當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合C.延伸當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈③PCR反應過程3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’一.目的基因的篩選與獲取4.利用PCR獲取和擴增目的基因第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應的模板，經(jīng)過變性、復性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應的模板，經(jīng)過變性、復性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物③PCR反應過程一.目的基因的篩選與獲取一.目的基因的篩選與獲?、跴CR反應過程比較項目細胞內DNA復制PCR技術區(qū)別解旋方式解旋酶催化邊解旋邊復制DNA在高溫下變性解旋全部解旋后在復制場所主要在細胞核內細胞外(主要在PCR擴增儀內)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高溫的DNA聚合酶溫度細胞內溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進行結果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3‘端合成子鏈

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。①基因組文庫：含有一種生物的全部基因。②部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫。（1）基因文庫類型：一.目的基因的篩選與獲?、軜嫿ɑ蛭膸靵慝@取目的基因（1）基因文庫類型：提取某種生物的全部DNA許多一定大小的DNA片段導入受體菌中儲存用適當?shù)南拗泼盖袑NA片段與載體連接基因組文庫①基因組文庫的構建模式圖某種生物特定發(fā)育時期的mRNA單鏈互補DNA雙鏈DNA片段

反（逆）轉錄酶DNA聚合酶cDNA文庫成熟mRNA與載體連接導入受體菌中儲存（1）基因文庫類型：②部分基因文庫的構建模式圖基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較

文庫類型cDNA文庫

基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內含子(位于編碼蛋白質序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以①

;②

。二.基因表達載體的構建1.目的使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用——核心步驟2.組成

當誘導物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達。（1）啟動子：一段有特殊序列結構的____片段。DNA①本質：②位置：位于基因的____，緊挨____________。上游轉錄的起始位點RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質。誘導型啟動子：（啟動子≠起始密碼）終止子啟動子目的基因標記基因復制原點基因表達載體（2）終止子：①本質：一段有特殊序列結構的____片段。DNA②位置：位于基因的_____。下游③功能：使轉錄在所需要的地方停下來。（3）標記基因：①作用：便于重組DNA分子的篩選。（4）目的基因：②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。如Bt基因,能控制表達所需要的特殊性狀。（5）復制原點：DNA復制的起始位點。注意：目的基因必須插入到

與

之間。啟動子終止子（終止子≠終止密碼）二.基因表達載體的構建2.組成辨析：“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”啟動子與終止子位于DNA分子中，作用：起始和終止轉錄過程。起始密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中，作用：起始和終止翻譯過程。二.基因表達載體的構建【思考1】重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因DNA連接酶基因表達載體構建模式圖限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復制原點質粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？二.基因表達載體的構建3.過程啟動子首端RNA聚合酶轉錄終止子尾端RNA聚合酶轉錄標記目的基因基因表達載體的組成：二.基因表達載體的構建【小結】第三步：將目的基因導入受體細胞基因表達載體受體細胞導入轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。動物植物微生物（一）導入植物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法(常用)

①導入方法1.花粉管通道法：我國科學家獨創(chuàng)②受體細胞：體細胞子房花粉柱頭花粉管精子卵細胞胚囊三、將目的基因導入受體細胞用微量注射器將含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中花粉管通道法子房注射花柱滴加在植物授粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ǖ倪^程：三、將目的基因導入受體細胞萌發(fā)的花粉管花柱子房胚囊卵細胞方法1花粉管通道法優(yōu)點柱頭①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進入胚囊，此時的受精卵未形成細胞壁，且正在進行活躍的DNA復制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。②操作簡單、技術成本低，免去了組織培養(yǎng)以及誘導再生植株的全套人工培養(yǎng)過程。三、將目的基因導入受體細胞①農桿菌特點：a.能在自然條件下侵染___________和_________，而對大多數(shù)___________沒有侵染能力；雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農桿菌細胞內含有______，當它侵染植物細胞后，能將______上的______（___________）轉移到被侵染的細胞，并且將其_________________________；Ti質粒Ti質粒T-DNA可轉移的DNA整合到該細胞的染色體DNA上

將目的基因插入_____________中，通過農桿菌的_____作用，就可以使目的基因___________②利用農桿菌進行轉化的思路：Ti質粒的T-DNA轉化進入植物細胞三、將目的基因導入受體細胞方法2農桿菌轉化法（最常用）Ti質粒T-DNA農桿菌③農桿菌轉化法的過程：T-DNA目的基因構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌含重組Ti質粒的農桿菌導入植物細胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養(yǎng)三、將目的基因導入受體細胞兩次拼接：第一次拼接是第二次拼接(非人工操作)指兩次導入：第一次導入是將第二次導入(非人工操作)是提醒：農桿菌轉化法中的兩次拼接、兩次導入三、將目的基因導入受體細胞將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上；被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌；指含目的基因的T-DNA導入受體細胞。

④轉化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片_______________，然后_____________，并__________；與農桿菌共培養(yǎng)篩選轉化細胞再生成植株b.可以將____直接浸沒在________________中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得____，再進行_____、_____等；花序含有農桿菌的溶液種子篩選鑒定三、將目的基因導入受體細胞隨著轉化方法的突破，用農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得成功?！@微注射法1.受體細胞：受精卵(因為受精卵容易表現(xiàn)出全能性)2.過程：構建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物（二）導入動物細胞三、將目的基因導入受體細胞——Ca2+處理法1.受體細胞：

常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌最廣泛。2.原核生物的優(yōu)點:

繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少、易于培養(yǎng)。3.一般過程:Ca2+處理大腸桿菌使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達載體導入其中（Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性）（感受態(tài)細胞）（三）導入微生物細胞Ca2+感受態(tài)細胞吸收三、將目的基因導入受體細胞實例：利用轉基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物注意：原核生物作為受體細胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性（無內質網(wǎng)和高爾基體加工），需要在體外進行再加工。三、將目的基因導入受體細胞種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法；花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子【小結】三.將目的基因導入受體細胞檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性；2.檢測內容及方法:四.目的基因的檢查與鑒定1.目的:（一）分子水平的檢測①檢測目的基因是否導入如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因——通過PCR等技術檢測提取棉花細胞DNA用與Bt基因相關的引物進行PCR擴增對擴增產(chǎn)物進行檢測四.目的基因的檢查與鑒定②檢測目的基因是否轉錄如：檢測Bt基因是否翻譯出mRNA提取棉花細胞mRNA逆轉錄產(chǎn)生DNA對擴增產(chǎn)物進行檢測用與Bt基因相關的引物進行PCR擴增——通過PCR等技術檢測（一）分子水平的檢測③檢測目的基因是否翻譯如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白從棉花中提取蛋白質用相應抗體進行抗原-抗體雜交檢測——通過抗原-抗體雜交檢測檢測目的基因是否表現(xiàn)出相應的性狀如：檢測抗蟲棉是否具有抗蟲性狀采摘抗蟲棉葉片飼喂棉鈴蟲觀察棉鈴蟲存活情況四.目的基因的檢查與鑒定（二）個體水平的檢測個體生物學水平的鑒定具體方法舉例轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正常四.目的基因的檢查與鑒定篩選和獲取目的基因獲取質粒、噬菌體等載體構建基因表達載體將含有目的基因的表達載體導入受體細胞檢測和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性基因工程的基本操作流程圖篩選和獲取目的基因1.利用PCR獲取和擴增目的基因2.人工合成目的基因3.通過構建基因文庫獲取目的基因第一步：目的基因的篩選與獲取構建基因表達載體1.用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段2.用DNA連接酶連接第二步：基因表達載體的構建將含有目的基因的表達載體導入受體細胞1.導入植物細胞：花粉管通道法；農桿菌轉化法2.導入動物細胞：顯微注射法3.導入原核細胞：用Ca2+處理受體細胞第三步：將目的基因導入受體細胞檢測和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性1.分子水平檢測①檢測目的基因是否導入（PCR等技術檢測）②檢測目的基因是否轉錄（PCR等技術檢測）③檢測目的基因是否翻譯（抗原-抗體檢測）2.個體水平檢測第四步：目的基因的檢測與鑒定探究?實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理（1）利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①PCR利用了DNA的_________原理，通過_________來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠________________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；熱變性調節(jié)溫度自動調控溫度30②PCR擴增DNA片段還利用了_________________的原理；DNA半保留復制基因工程的基本操作程序（2）DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在_____的作用下，這些________會向著__________________的電極移動，這個過程就是_____；可解離的基團pH電場帶電分子電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過_______________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、________________和_____等有關（遷移速率與之呈負相關）④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為________的______下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構象基因工程的基本操作程序2.材料用具①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）基因工程的基本操作程序10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等基因工程的基本操作程序3.方法步驟基因工程的基本操作程序PCR反應體系的配方10倍濃縮的擴增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL總體積50μL注：模板DNA的用量為1gp～1μg①移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分（1）DNA片段的擴增3.方法步驟基因工程的基本操作程序循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。③反應：參照上表的參數(shù)，設