植物遺傳轉(zhuǎn)化

第十七章：植物遺傳轉(zhuǎn)化Section1:植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法Section2:轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)Section3:幾種植株遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)植物遺傳轉(zhuǎn)化（plangenetictransformation):

應(yīng)用重組DNA技術(shù)、細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)，有目的地將外源基因或DNA片段插入到受體植物基因組中并通過(guò)減數(shù)分裂獲得新植株的技術(shù)。

第一類(lèi)：外源裸露基因的直接導(dǎo)入法；通過(guò)物理或化學(xué)的方法直接將外源目的基因?qū)胫参锘蚪M中?；驑屴D(zhuǎn)化法第二類(lèi)：載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法；通過(guò)將目的基因連接在植物表達(dá)載體上，隨著載體DNA的轉(zhuǎn)移而將外源目的基因整合到植物基因組中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法第三類(lèi)：種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)法；包括植物原位真空滲入法和花粉管通道法。Section1:植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法（一）基因槍法基因槍法是指用鎢粉或金粉包裹外源ＤＮＡ，而后依靠基因槍裝置，利用高壓氦氣沖擊波加速微彈去穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使外源ＤＮＡ進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到植物細(xì)胞染色體組中，從而達(dá)到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的目的。（1）原理：基因槍法把遺傳物質(zhì)或其他物質(zhì)附著于高速微彈直接射入細(xì)胞、組織和細(xì)胞器。氣體基因槍可在廣泛的細(xì)胞型中得到瞬時(shí)的、穩(wěn)定的和高效率的轉(zhuǎn)化作用。氣體基因槍有一個(gè)產(chǎn)生沖擊波的特殊結(jié)構(gòu)，在恰當(dāng)?shù)臍鈮悍秶鷥?nèi)從3.5MPa-10MPa，具有相應(yīng)不同的可破裂膜，將包覆DNA的粒子穿越，射入在轟擊室底部的靶細(xì)胞中。（2）程序與方法：①轟擊微彈的制備②基因槍轟擊參數(shù)

③受體材料④轟擊樣品①（3）基因槍法優(yōu)缺點(diǎn)基因槍法優(yōu)點(diǎn)：①無(wú)宿主限制②受體類(lèi)型廣泛③質(zhì)粒構(gòu)造簡(jiǎn)單基因槍法缺點(diǎn)：

①儀器設(shè)備，轟擊微彈的制備等較為昂貴

②整合的外源基因拷貝數(shù)不易控制

③轟擊對(duì)細(xì)胞損傷大等（二）農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（1）原理：農(nóng)桿菌

是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)后，可將T-DNA插入到植物基因中。農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。

（2）方法：人們將目的基因插入到經(jīng)過(guò)改造的T—DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來(lái)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物(尤其是水稻)中也得到了廣泛應(yīng)用。（3）轉(zhuǎn)化步驟可簡(jiǎn)單概括為以下方面：

1、獲取目的基因。用限制酶切割下目的基因。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建。將目的基因與載體（大多數(shù)選用質(zhì)粒）用DNA連接酶連接起來(lái)。3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。將含目的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌（農(nóng)桿菌為受體細(xì)胞）。4、目的基因的檢測(cè)與鑒定。用DNA分子雜交技術(shù)/分子雜交技術(shù)/抗原-抗體雜交/個(gè)體生物學(xué)水平鑒定（這個(gè)方法需要導(dǎo)入重組后的細(xì)胞的植物體，詳見(jiàn)第五步）幾種方法進(jìn)行檢驗(yàn)（根據(jù)要求選取不同方法）。5、最后將成功表達(dá)的細(xì)胞導(dǎo)入植物體內(nèi)，對(duì)植物體進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平鑒定。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的過(guò)程（4）優(yōu)缺點(diǎn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法優(yōu)點(diǎn)：①轉(zhuǎn)化頻率較高。

②轉(zhuǎn)移的外源片段較大。

③整合的外源基因多為單拷貝。④整合到植物基因組的外源基因可以定向表達(dá)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法缺點(diǎn)：①受體植物基因型限制。

②農(nóng)桿菌是一個(gè)生物有機(jī)體，轉(zhuǎn)化受植物材料的影響大。（三）其他常用的轉(zhuǎn)換方法（1）植株原位真空滲入法（2）

聚乙二醇法（3）

脂質(zhì)體介導(dǎo)法（4）電擊法（5）體內(nèi)注射法（6）碳化硅纖維介導(dǎo)法Section2:轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè)

以報(bào)告基因檢測(cè)為例：

報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。目前主要的報(bào)告基因如下：Section3:幾種植株遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)（一）大田作物遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)①油菜的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：根據(jù)不同的基因型選擇適的培養(yǎng)基。

外源基因直接導(dǎo)入法：有點(diǎn)擊法、PEG法、顯微注射法、

花粉介導(dǎo)法等。②棉花的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

花粉管通道法

基因槍法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花（二）園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)

①黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化

黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的方法與結(jié)果

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)

根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)

花粉管通道

floraldip法②花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化

十字花科，具有良好的再生能力?；ㄒ诉z傳轉(zhuǎn)化方法如圖：發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)根瘤農(nóng)桿菌