內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1α在干細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用機(jī)制,病理學(xué)論文

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1α在干細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用機(jī)制,病理學(xué)論文0引言內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERS)是指在多種生理或病理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡或蛋白質(zhì)加工運(yùn)輸障礙、生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器的病理經(jīng)過[1-3],牽涉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類似激酶(proteinkinaseRNA-likeendoplas-micreticulumkinase,PERK)/真核細(xì)胞翻譯起始因子2(eukaryoticinitiationfactor2,eIF2)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(activatingtranscriptionfactor6,ATF6)和需肌醇酶-1(inositol-requiringkinase1,IRE-1)/X盒結(jié)合蛋白-1(X-boxbindingpro-tein-1,XBP-1)等信號(hào)通路[4-6],而葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulatedprotein78,GRP78)是細(xì)胞ERS狀態(tài)的標(biāo)志物[7,8].內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化復(fù)原酶-1(endoplasmicreticulumoxidoreductin1,ERO1)是調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白合成、折疊的關(guān)鍵基因[9,10].同型半胱氨酸(homocyste-ine,Hcy)是多種疾病的危險(xiǎn)因子,可引起肝臟ERS[11,12].本研究主要討論Hcy誘導(dǎo)肝細(xì)胞ERS經(jīng)過中ERO1的調(diào)控作用及可能機(jī)制,為進(jìn)一步尋找Hcy致肝臟ERS中的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)根據(jù).1材料和方式方法1.1材料HL7220肝細(xì)胞株(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心,中國(guó));超凈工作臺(tái)(蘇州安樂空氣技術(shù)有限公司,中國(guó));CO2培養(yǎng)箱(Heraeus,德國(guó));5415D型微量臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó));BS110S型精致細(xì)密天平(Sartorius,德國(guó));熒光顯微鏡(奧林巴斯公司,日本);熒光定量PCR儀(上海楓嶺生物技術(shù)有限公司,中國(guó));垂直電泳儀和Model680全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司,美國(guó));HyCloneRPMI1640培養(yǎng)基(Thermo);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);Hcy(Sigma);RNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司,中國(guó));逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司);蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,中國(guó));ERO1兔抗人一抗(Abcam公司),辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,中國(guó));GRP78、PERK、ATF6、XBP-1ELISA試劑盒(北京雅安達(dá)公司,中國(guó));引物由上海生工生物工程有限公司合成.1.2方式方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):將人肝細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng).細(xì)胞密度到達(dá)80%左右時(shí),用終濃度為0、50、100、200、500mol/LHcy和100mol/LHcy+葉酸+VB12干涉,華而不實(shí)0mol/LHcy為對(duì)照組,48h后收集細(xì)胞,用于后續(xù)試驗(yàn).1.2.2ELISA檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK、ATF6、XBP-1的水平:ELISA試劑盒室溫平衡15min,分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔.空白孔加樣品稀釋液100L,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100L(待測(cè)樣品蛋白上樣濃度統(tǒng)一為21g/L),37℃反響30min.洗板5次,各1min,拍干.每孔加酶標(biāo)液100L,37℃反響30min,洗板5次,各1min,拍干.加顯色試劑A液和B液,37℃顯色15min.加終止液,15min內(nèi),酶標(biāo)儀上讀取各孔A450值.1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ERO1mRNA水平:根據(jù)RNA提取試劑盒講明書提取細(xì)胞RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完好性.按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒講明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物,ERO1:5-ATCCTTTG-GCTTCTGGTCAAG-3(上游)和5-GTTGT-GTCCCCATTTCTTTTCT-3(下游);-actin:5-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3(上游)和5-CTGGAAGGTGGACAGCGACG-3(下游).PCR條件:94℃預(yù)變性10min,94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延長(zhǎng)30s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán).待反響結(jié)束后,結(jié)合擴(kuò)增曲線及溶解曲線,選擇符合要求的qRT-PCR原始數(shù)據(jù),結(jié)果用2-△△CT法分析.1.2.4Westernblot檢測(cè)ERO1的蛋白表示出改變:細(xì)胞裂解法提取各組細(xì)胞總蛋白,取總蛋白18L,經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳,80V30min,120V60min,15V恒壓轉(zhuǎn)膜10min,與ERO1特異性一抗4℃過夜;與二抗室溫孵育1.5h后,參加顯色底物,以-actin為內(nèi)參,凝膠成像分析儀上成像分析,計(jì)算ERO1與-actin灰度值的比值,進(jìn)行分析.1.2.5ERO1重組質(zhì)粒及siRNA質(zhì)粒構(gòu)建:ERO1重組質(zhì)粒委托上海漢恒生物技術(shù)有限公司完成.ERO1三個(gè)不同siRNA片段委托上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司完成.1.2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前2d取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肝細(xì)胞接種于6孔板中,分別用空質(zhì)粒(pEGFP-N1)和ERO1重組質(zhì)粒(pERO1)及siRNA三個(gè)不同片段轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞,并設(shè)立空白對(duì)照組.操作步驟:LipofectamineTM2000(L)和質(zhì)粒DNA(g)比例為3∶1,分別溶于無血清培養(yǎng)液中,室溫孵育5min后將兩者混勻,室溫孵育20min,與適量無血清培養(yǎng)液輕輕混勻后參加細(xì)胞中,6h后棄培養(yǎng)液,參加含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后,熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Prism6.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料以meanSD表示,兩組間比擬采用t檢驗(yàn),多組間兩兩比擬采用單因素方差分析,P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1Hcy對(duì)肝細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白GRP78、XBP-1、PERK及ATF6的影響用100?mol/LHcy干涉肝細(xì)胞后,ERS相關(guān)蛋白GRP78、XBP-1、PERK及ATF6的含量較對(duì)照組分別升高了1.29、1.27、1.06、1.08倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖1).2.2不同濃度Hcy對(duì)肝細(xì)胞ERO1表示出的影響分別用0、50、100、200、500?mol/LHcy干涉肝細(xì)胞后,ERO1mRNA和蛋白表示出水平均有所降低.華而不實(shí)50?mol/L組與0?mol/L組比擬無明顯差異;其余組隨著Hcy濃度的增加,ERO1mRNA和蛋白表示出水平均顯著減少(P0.01),且呈劑量依靠關(guān)系;而給予葉酸和VB12干涉后,ERO1表示出水平明顯增加(P0.01)(圖2).2.3熒光倒置顯微鏡觀察肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為了分析ERO1對(duì)肝細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白的調(diào)控作用,運(yùn)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pEGFP-N1、pERO1重組質(zhì)粒及siRNA三個(gè)不同片段轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞48h后,熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白表示出明顯,講明轉(zhuǎn)染成功,能夠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖3).2.4驗(yàn)證基因重組或RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞后ERO1表示出改變將pEGFP-N1空質(zhì)粒及ERO1過表示出質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞,檢測(cè)ERO1mRNA及蛋白表示出,結(jié)果顯示pERO1組ERO1mRNA及蛋白表示出水平明顯增加(P0.01)(圖4A,B),證實(shí)pERO1轉(zhuǎn)染成功;將三個(gè)不同的ERO1siRNA片段轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞,三個(gè)片段均能夠降低ERO1mRNA及蛋白表示出明顯增加(P0.01),尤其以siRNA2作用最為明顯(圖4C,D).2.5ERO1表示出改變對(duì)肝細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白表示出的影響為了進(jìn)一步明確ERO1在Hcy誘導(dǎo)肝細(xì)胞ERS中的作用,分別將ERO1過表示出質(zhì)粒及ERO1siRNA片段轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞并與Hcy(100?mol/L)共同孵育48h后,檢測(cè)GRP78、ATF6、PERK、XBP-1的表示出變化,結(jié)果顯示與Hcy組相比,Hcy+pERO1組GRP78、ATF6、PERK、XBP-1均明顯降低(P0.01);而Hcy+siRNA2組,GRP78、ATF6、PERK、XBP-1均明顯升高(P0.01)(圖5).3討論ERS反響是細(xì)胞的一種自我保衛(wèi)機(jī)制,在保衛(wèi)機(jī)體有效應(yīng)對(duì)各種外在刺激中牽涉多個(gè)信號(hào)通路及相關(guān)基因的表示出調(diào)控,構(gòu)成一個(gè)完好體系,發(fā)揮維持細(xì)胞存活和凋亡平衡的重要調(diào)節(jié)作用[13,14].適度的ERS反響有助于保衛(wèi)細(xì)胞,維持生存,但ERS反響過強(qiáng)不可逆轉(zhuǎn)時(shí)則可引起細(xì)胞功能障礙,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展[15].Hcy是一種含硫氨基酸,是體內(nèi)蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物,正常機(jī)體中含量很低,當(dāng)Hcy代謝受阻,就會(huì)在體內(nèi)積聚,使其在血中的水平持續(xù)升高發(fā)生高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocystein-emia,HHcy)[16,17],是臨床多種疾病的危險(xiǎn)因素[18].研究[19,20]顯示:Hcy介入心肌細(xì)胞ERS,為ERS的誘導(dǎo)因素之一,而肝臟是調(diào)節(jié)Hcy代謝的重要器官,含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在調(diào)節(jié)Hcy代謝經(jīng)過中,更容易發(fā)生ERS反響[21,22].GRP78是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶,是ERS反響的主要標(biāo)志性蛋白,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非應(yīng)激狀態(tài)下,PERK、ATF6、IRE1與GRP78結(jié)合處于非活性狀態(tài),ERS時(shí),GRP78則與這三種轉(zhuǎn)錄因子解離并啟動(dòng)PERK/eIF2、ATF6、IRE-1/XBP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[23].本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示Hcy干涉后,肝細(xì)胞內(nèi)GRP78、PERK、ATF6與XBP-1表示出升高,表示清楚Hcy可導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生ERS.ERO1定位于人14號(hào)染色體上,是一種緊貼于ER膜腔面的糖基化黃素酶,主要介入維持ER內(nèi)氧化狀態(tài)[24].ERO1介入氧化二硫鍵異構(gòu)酶,維持蛋白折疊經(jīng)過能夠持續(xù)進(jìn)行[25].ERO1在構(gòu)成二硫鍵的經(jīng)過中可產(chǎn)生H2O2,因而ERO1激活是細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)產(chǎn)生的重要來源之一[26].太多的ROS產(chǎn)生,超過細(xì)胞抗氧化防御能力就會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)氧化復(fù)原穩(wěn)態(tài),引起氧化應(yīng)激和ERS等經(jīng)過[27].人類細(xì)胞中含有兩種ERO1同源異構(gòu)體,ERO1和ERO1.Wright等[28]發(fā)現(xiàn),ERO1限制胰島素原突變體誘導(dǎo)的ERS.另有研究[29,30]發(fā)現(xiàn),ERO1蛋白可能介入高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,并能夠作為ERS導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路的重要標(biāo)志蛋白,表示清楚ERO1是調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白合成、折疊的關(guān)鍵基因.我們用不同濃度Hcy刺激肝細(xì)胞,結(jié)果顯示,Hcy能夠引起ER