第2篇 蛋白類生物活性物質(zhì)

第一章蛋白類生物活性物質(zhì)目錄一.免疫球蛋白

基本概念、分布、結(jié)構(gòu)與組成牛乳中的免疫球蛋白、免疫球蛋白的生物學(xué)功能二.乳鐵蛋白

基本性質(zhì)、生物活性及其影響因素乳鐵蛋白的分離方法2第一節(jié).免疫球蛋白一、免疫球蛋白基本概念（1）免疫球蛋白（Immunoglobulin，簡稱Ig）是一類具有抗體活性，能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。免疫球蛋白不僅存在于血液中，還存在于體液、粘膜分泌液以及B淋巴細胞膜中。它是構(gòu)成體液免疫作用的主要物質(zhì)，與補體結(jié)合后可殺死細菌和病毒，因此，可增強機體的防御能力。目前，食物來源的免疫球蛋白主要是來自乳、蛋等畜產(chǎn)品。特別是近年來人們對牛初乳和蛋黃來源的免疫球蛋白研究開發(fā)的較多。（2）免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與組成4免疫球蛋白基本結(jié)構(gòu)1、基本結(jié)構(gòu)：鏈間二硫鍵連接四肽鏈構(gòu)成單體。重鏈和輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域（功能區(qū)）5重鏈和輕鏈重鏈(heavychain，H)：由450～550個氨基酸殘基組成，根據(jù)重鏈恒定區(qū)免疫原性的差異分5類

IgM.(μ鏈)、IgD(δ鏈)、IgG.(γ鏈)、IgA.(α鏈)、IgE.(ε鏈)。輕鏈(lightchain，L)：由214個氨基酸殘基組成，根據(jù)輕鏈恒定區(qū)免疫原性的差異分為兩型κ型、λ型。型型6可變區(qū)和恒定區(qū)7可變區(qū)：N端1／4區(qū)域因氨基酸組成及排列順序多變，稱重鏈可變區(qū)（VH區(qū)），特別是其中第31～35，49～66，86～91和101～110位置上的氨基酸具有更大的變異性，稱之為超變區(qū)（HV區(qū)）。恒定區(qū)：重鏈可變區(qū)中非HV區(qū)部分稱為骨架區(qū)。重鏈剩余3／4區(qū)域因氨基酸組成和排列順序變化較小且相對穩(wěn)定，稱重鏈恒定區(qū)（CH區(qū)）。鉸鏈區(qū)Hingeregion位置

位于CH1與CH2之間(IgM和IgE無鉸鏈區(qū))特點

(1)富含脯氨酸，易伸展彎曲，有利于結(jié)合Ag表位；

(2)對蛋白酶（木瓜蛋白酶和胃蛋白酶）敏感。8Ig的多肽分子約110個氨基酸可折疊由鏈內(nèi)二硫鍵連接的、具有特定功能的單位。功能區(qū)（結(jié)構(gòu)域domain）9第三節(jié)各種Ig的分類試比較各類Ig的異同點?10DepartmentofMicrobiology&Immunology?2006MBS2023/2/311免疫球蛋白A結(jié)構(gòu)12免疫球蛋白G結(jié)構(gòu)131)工gG:出生3個月開始形成。血清中主要的杭體成分，在機體免疫防護中起著主要的作用，約占血清總工g的75%。工gG是唯一能通過胎盤的工g。血清和細胞外液中含量最高，唯一通過胎盤；半衰期20-23天，再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體；功能：抗感染（抗菌、抗病毒和中和毒素）；調(diào)理作用、ADCC，活化補體，協(xié)同凝集及引起II、III型超敏反應(yīng)等；運用：結(jié)合SPA（葡萄球菌蛋白Ａ），純化抗體，并用于免疫診斷。IgG—機體抗感染的“主力軍”14IgM—機體抗感染的“先頭部隊”血清型（五聚體）分子量最大；個體發(fā)育中合成最早，機體受Ag刺激后最早出現(xiàn)的抗體，分布于血清內(nèi)，半衰期較短。天然（血型）抗體、類風(fēng)濕因子屬此類功能具有強大的殺菌、激活補體、免疫調(diào)理和凝集作用運用感染的早期診斷，宮內(nèi)感染（臍帶血IgM水平增高）膜型（單聚體）B淋巴細胞膜表面；是B細胞表面特有標志。15血清型：單體，有IgA1和IgA2亞類分泌型（SIgA）：雙體主要分布：初乳、唾液、淚液及與粘膜相關(guān)的外分泌液中。（嬰兒可從初乳中獲得高濃度的SIgA為自然被動免疫）功能：局部抗感染。IgA—機體抗感染的“邊防軍”16IgD—B細胞分化成熟標記血清中含量低（1%），半衰期3天，其作用尚不清楚mIgD可作為B細胞分化成熟標記，成熟B細胞同時表達mIgM和mIgD。mIgMmIgD成熟B細胞活化B細胞未成熟B細胞17IgE—親細胞抗體正常人血清含量極低；過敏性疾病和腸道蠕蟲感染時，IgE對肥大細胞及嗜堿性粒細胞具有高度親和性。功能參與I型超敏反應(yīng)；抗寄生蟲感染等。18（3）牛乳中免疫球蛋白乳?；蚱渌锓N通過乳腺分泌的免疫球蛋白并非乳腺獨有的產(chǎn)物，乳腺局部合成與機體其他部位合成的免疫球蛋白完全相同?，F(xiàn)已經(jīng)證實，牛初乳中存在IgG、IgA、IgM、IgE和lgD等5類Ig，其中IgD尚未發(fā)現(xiàn)具有作為功能性食品的潛力。IgG是牛初乳和常乳中含量最高的Ig，例如牛初乳中IgG占Ig總量的55％以上。IgG占血清Ig總量的75％～80％，多以單位形式存在，分子質(zhì)量為149680。IgG也是血清半衰期（約23天）最長的Ig，主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細胞合成，是機體重要的抗菌、抗病毒和抗毒素抗體。牛初乳Ig在乳牛體內(nèi)半衰期約21天，但牛犢持續(xù)攝入初乳在4～6個月內(nèi)均有較強的抗病能力。IgG更是惟一能通過胎盤的抗體，故對哺乳動物新生幼仔、新生兒抗感染起重要作用，通常嬰兒出生后3個月內(nèi)不能合成IgG。牛乳和人乳免疫球蛋白含量比較（4）免疫球蛋白的生物學(xué)功能（一）與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合：免疫球蛋白最主要的功能是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，在體外引起各種抗原-抗體的反應(yīng)?？乖梢允乔秩肴梭w的菌體、病毒或毒素，它們被Ig特異性結(jié)合后便喪失破壞機體健康的能力。需指出，若Ig發(fā)生變性，空間構(gòu)象發(fā)生變化便可能無法與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，即喪失了相應(yīng)的抗病能力。（二）活化補體：IgG1～3和IgM與相應(yīng)抗原結(jié)合后，可活化補體經(jīng)典途徑（Classicalpathway，CP），即抗原—抗體復(fù)合物刺激補體固有成分C1－C9發(fā)生酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，最終發(fā)生細胞溶解作用的補體活化途徑。（三）結(jié)合細胞產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)：免疫球蛋白（Ig）能夠通過其FC段與多種細胞（表面具有相應(yīng)FC受體）結(jié)合，從而產(chǎn)生多種不同的生物效應(yīng)。（四）通過胎盤傳遞免疫力：Ig的轉(zhuǎn)移方式，不同類型的Ig在不同的動物的母體和幼體間有不同的Ig轉(zhuǎn)移方式，對于在多種病原菌中出生的幼體，母親傳遞給幼體多種抑菌物質(zhì)，Ig是其中最主要的一種。2223免疫球蛋白V區(qū)的功能特異性識別結(jié)合抗原中和毒素阻斷病原體入侵C區(qū)的功能激活補體：溶解細胞或細菌人IgG1-3，IgM活化補體經(jīng)典途徑；凝集IgG4，IgA活化補體旁路途徑。IgG1～3和IgM與相應(yīng)抗原結(jié)合后，可活化補體經(jīng)典途徑（CP），即抗原—抗體復(fù)合物刺激補體固有成分C1－C9發(fā)生酶促連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，最終發(fā)生細胞溶解作用的補體活化途徑。24細胞親嗜性與細胞表面FcR結(jié)合251、調(diào)理作用；2、抗體依賴與吞噬細胞介導(dǎo)的細胞毒作用；3、介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)26第二節(jié).乳鐵蛋白一、Lf的基本結(jié)構(gòu)和組成乳鐵蛋白是一種天然蛋白質(zhì)的降解物，存在于牛乳和母乳中。乳鐵蛋白晶體呈紅色，是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，相對分子質(zhì)量為77100±1500。牛乳鐵蛋白的等電點（pI）為8，比乳鐵蛋白高2個pH單位。在1分子乳鐵蛋白中，含有2個鐵結(jié)合部位。其分子由單一肽鍵構(gòu)成，谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量較高；除含少量半胱氨酸外，幾乎不含其他含硫氨基酸；終端含有一個丙氨酸基團。通過Lf的組成和氨基酸順序分析，證明它是由轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）演變而來。各種哺乳動物（如人、羊、牛）的乳鐵蛋白在氨基酸排列上有較小的差異。Lf的相對分子質(zhì)量是77000±2000，它是一種鐵結(jié)合糖蛋白，1分子Lf能結(jié)合兩個Fe3＋離子，含15～16個甘露糖，5～6個半乳糖，10～11個乙酰葡萄糖胺和1個唾液酸，其中中性糖8.5％，氨糖2.7％。（二）Lf的金屬結(jié)合性質(zhì)1分子飽和Lf中含兩個Fe3＋離子。乳鐵蛋白不僅能結(jié)合Fe3＋，且對Cu2＋也有結(jié)合作用，其結(jié)合能力也是每個Lf分子含兩個Cu2＋。在乳鐵蛋白和Fe或Cu形成絡(luò)合物的過程中有碳酸氫鹽的參與，F(xiàn)e或Cu和碳酸氫鹽的比例為1︰1，碳酸氫鹽的存在對絡(luò)合物的生成有催化作用。維生素C對缺鐵Lf的飽和過程也有催化作用，維生素C的存在有利于飽和Lf的形成，Tf也有類似的性質(zhì)。用XRD實驗證實，Tf的鐵結(jié)合2個酪氨酸，1個組氨酸，1個天冬氨酸和碳酸根，碳酸根上連接1個精氨酸和水分子，這種模式是否和Lf一樣，尚需實驗的進一步證實。（三）Lf的生物活性乳鐵蛋白具有結(jié)合并轉(zhuǎn)運鐵的能力，到達人體腸道的特殊接受細胞中后再釋放出鐵，這樣就能增強鐵的吸收利用率，降低有效鐵的使用量，減少鐵的負面影響。乳鐵蛋白還有多種生物活性，歸納起來有以下幾個方面：①刺激腸道中鐵的吸收。②抑菌作用，抗病毒效應(yīng)。③調(diào)節(jié)吞噬細胞功能。④調(diào)節(jié)發(fā)炎反應(yīng)，抑制感染部位炎癥。⑤抑制由于Fe2＋引起的脂氧化，F(xiàn)e2＋或Fe3＋的生物還原劑（如抗壞血酸鹽）是脂氧化的誘導(dǎo)劑。（四）Lf生物活性的影響因素鐵蛋白的生物活性受多種因素的制約，鹽類、鐵含量、pH、抗體或其他免疫物質(zhì)、介質(zhì)等均有影響。它的鐵含量對其抑菌作用有決定性作用，碳酸鹽的存在可明顯增強其抑菌能力，而檸檬酸鹽的增加卻明顯減弱其抑菌能力。另外，它的抑菌效果還與pH密切相關(guān)，在pH7.4時效果明顯高于pH6.8，pH<6基本無抑菌作用。Lf對多種病原菌有抑制作用，服用含Lf的食品或制劑，對抑制腸道的病原菌，增加有益菌類和平衡腸道菌群，均有較好的作用。二、Lf的分離方法目前報道的Lf分離方法很多，主要有色譜法（吸附色譜法、離子交換色譜法、親合色譜法、固定化單系抗體法等）和超濾法。色譜法的優(yōu)點是分離效果好、純度高，抗體被固定化可重復(fù)使用，其缺點是柱的制備工藝復(fù)雜，抗體成本昂貴，難以工業(yè)化生產(chǎn)。超濾法操作簡便，費用相對較低，易于形成工業(yè)化規(guī)模，其缺點是乳鐵蛋白純度較低，膜需經(jīng)常清洗。超濾法是生產(chǎn)食品用乳鐵蛋白最具實現(xiàn)工業(yè)化潛力的方法之一。習(xí)題集1．下列五類Ig的特性哪項是錯誤的IgG是唯一通過胎盤的免疫球蛋白SIgA多為雙聚體IgM分子量最大免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生最早的是IgG正常血清中IgE含量最少2．Ig分成五類的依據(jù)是VL抗原特異性的不同VH抗原特異性的不同CL抗原特異性的不同CH抗原特異性的不同CL及CH抗原特異性的不同324．下列哪種液體中分泌型IgA的含量最高唾液尿液初乳支氣管粘液腸道分泌液習(xí)題集5．五種免疫球蛋白的分類是根據(jù)H鏈和L鏈均不同V區(qū)不同L鏈不同H鏈不同連接H鏈的二硫鍵位置和數(shù)目不同6．半衰期最長的Ig是IgMIgEIgGIgAIgD337．Ig分成各種型及亞型的依據(jù)是VL抗原特異性的不同VH抗原特異性的不同CL抗原特異性的不同CH抗原特異性的不同CL及CH抗原特異性的不同習(xí)題集8．胎兒在宮腔內(nèi)感染，臍帶血或新生兒外周血中何種Ig水平升高IgMIgEIgGIgAIgD9．免疫球蛋白的超變區(qū)位于VH和CHVL和VHFC段VH和CLCL和CH3410．在局部黏膜抗感染中發(fā)揮重要作用的Ig是IgMIgGIgESIgAIgD11．新生兒通過自然被動免疫從母體獲得的主要Ig是A.IgG和IgMB.IgD和SIgAC.SIgA和IgGD.IgM和IgEE.IgE和IgD習(xí)題集12．能通過經(jīng)典途徑激活補體的Ig是IgG1、IgG2、IgG4、IgMIgG1、IgG2、IgG3、IgMIgG、IgA、IgE、IgM聚集的IgG4、IgA、IgEIgG4、IgA、IgE、IgD13．3～6個月嬰兒易患呼吸道感染主要是因為哪類Ig不足A.IgMB.IgGC.IgED.SIgAE.IgD3514．免疫接種后首先產(chǎn)生的抗體是IgMIgGIgEIgAIgD15．IgG通過經(jīng)典途徑激活補體至少需要1個2個4個5個3個習(xí)題集16．免疫調(diào)理作用最強的Ig是IgMIgGIgEIgAIgD3617．關(guān)于ADCC的敘述，下列哪項是正確的IgM可介導(dǎo)ADCCMφ不具有ADCCCTL可通過ADCC殺傷靶細胞ADCC的殺傷作用是非特異性的ADCC需要補體參與18．關(guān)于抗體，下列哪項是錯誤的抗體是指具有免疫功能的球蛋白抗體主要存在于血液、體液、粘膜表面及其分泌液中抗體是能和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的球蛋白抗體都是免疫球蛋白抗體都是體內(nèi)產(chǎn)生的19．下列分泌液中不含IgA的是A.唾液B.初乳C.汗液D.腸道分泌液E.支氣管黏液習(xí)題集20．各種Ig單體分子共有的特性是與靶細胞結(jié)合后能介導(dǎo)ADCC作用具有兩個完全相同的抗原結(jié)合部位輕鏈與重鏈以非共價鍵結(jié)合與抗原結(jié)合后能激活補體與顆粒性抗原結(jié)合后能介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用21．