Chapter Ⅲ 菌種保藏原理與方法

ChapterⅢ

菌種的復(fù)壯與保藏方法第一節(jié)菌種的衰退與復(fù)壯一、衰退的原因：

衰退（degeneration）：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。1、基因突變核基因突變質(zhì)粒脫落（根本原因）2、連續(xù)移代（加速退化的直接原因）3、培養(yǎng)和保藏條件的影響常見的衰退現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降；防止菌種衰退的方法：

①控制傳代次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過程中，堿基的錯配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8~10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的數(shù)）；

②選擇合適的培養(yǎng)條件；

③采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代（對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種）；

④采用有效的菌種保藏方法。二、衰退的防止三、菌種的復(fù)壯

菌種的復(fù)壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀。狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種菌種的復(fù)壯措施：

①純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）。

②通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯

③淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。

④采用有效的菌種保藏方法。第二節(jié)工業(yè)微生物菌種的保藏一、目的：

①存活，不丟失，不污染

②防止優(yōu)良性狀喪失

③隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種

二、原理：選用優(yōu)良的純種，（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等），創(chuàng)造降低微生物代謝活動強(qiáng)度，生長繁殖受抑制，難以發(fā)生突變的環(huán)境條件。（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑等）

菌連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種種生活態(tài)傳代培養(yǎng)保藏法連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種保固體斜面藏濕法半固體瓊脂柱方休眠態(tài)液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管內(nèi)吸附在合適的載體上三、菌種保藏的方法1、冷凍保藏法

方法：菌種管低溫保藏，定時傳代

原理：低溫下，微生物代謝強(qiáng)度明顯下降。

冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。冷凍保藏時溫度要求在-20℃以下，同時應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。冷凍保藏種類

①

普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)②

超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)③

液氮冷凍保藏技術(shù)普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中?；蛘?，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80℃)

要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60℃以下進(jìn)行保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：

1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；

2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；

3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；

4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。液氮冷凍保藏技術(shù)

冷凍保護(hù)劑在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油—般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟

1．待冷凍保藏菌種懸液的制備

(1)從生長斜面制備菌懸液：每一斜面加入5ml含10％甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5～lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，

(2)從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液：在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。2．控速冷凍．(1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2℃/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30℃)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時盡可能快地發(fā)生相變；(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃/min，直到溫度達(dá)-50℃；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96℃)或氣相(-156℃)中保存。如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。3.復(fù)蘇A從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；B迅速將安瓿置于37-40℃水浴中，并輕輕搖動以加速解；C用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml(約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。3.干燥保藏法將菌種置于土壤、細(xì)紗、濾紙、硅膠等干燥材料上保藏。如砂土管法，適用于放線菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏時間幾至幾十年。2.石蠟油低溫保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蠟油。4.真空冷凍干燥法加有保護(hù)劑的菌懸液在凍結(jié)狀態(tài)下予以真空干燥。適用于各種微生物，便于大量保藏，菌種存活時間長，是目前最好的保藏方法。5

基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長非必需。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。菌種保藏機(jī)構(gòu)的任務(wù)：廣泛收集科研和生產(chǎn)菌種、菌株，并加以妥善保管，使之達(dá)到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。菌種保藏機(jī)構(gòu)：

中國微生物菌種保藏委員會(CCCCM)

中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)

美國典型菌種保藏中心(ATCC)

英國國家典型菌種保藏所（NCTC）

法國里昂巴斯德研究所（IPL）國內(nèi)外菌種保藏機(jī)構(gòu)：干法保藏菌種的方法

滴入小試管（在放入大試管干燥器中）藏在玻璃管內(nèi)封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法）冷凍真空干燥法

細(xì)粒狀載體（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球塊狀載體（硅膠、瓷球）合適的載體有機(jī)基質(zhì)（曲料、麥粒）

濾紙片薄片狀載體明膠小片（滴在蠟紙板上干燥而成）血清蛋白小片（…乙烯薄膜…）