第十四章 電泳分離技術(shù)

第十四章電泳分離技術(shù)一、電泳技術(shù)概述1937年，瑞典科學(xué)家Tiselius設(shè)計了世界上第一臺電泳儀，建立了移界電泳法，并于1948年榮獲諾貝爾獎。20世紀(jì)50年代，許多科學(xué)家著手改進(jìn)電泳儀，尋找合適的電泳支持介質(zhì)，先后找到濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉及瓊脂作為支持物。60年代，Davis等科學(xué)家利用聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù)。這些技術(shù)具有設(shè)備簡單，操作方便，分辨率高等優(yōu)點。

電泳技術(shù)概述70年以來，電泳技術(shù)圍繞制膠、電泳、染色三個技術(shù)環(huán)節(jié)，不斷改進(jìn)，以實現(xiàn)下列目標(biāo)：

1、提高分辨率及靈敏度。

2、簡化操作，縮短電泳時間。

3、擴(kuò)大應(yīng)用范圍。目前，電泳技術(shù)已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)以及與其密切相關(guān)的醫(yī)學(xué)、農(nóng)、林、牧、漁、制藥及某些工業(yè)分析中必不可少的手段。

電泳是指帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。二、電泳技術(shù)的基本原理蛋白質(zhì)分子在不同pH下的解離狀態(tài)

NH3+NH3+NH2PPPCOOHCOO-COO-

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

pH>pI

分子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動;pH<pI分子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動;u:泳動度or泳動率(cm/伏·秒or分)V:泳動速度:cm/秒or分E:電場強(qiáng)度:伏特/cmd:泳動距離:cmt:電泳時間:秒/分U:電壓:常壓(100—500v)

高壓(500—10000v)僅需幾分鐘l:支持場的長度(有效長度)(一)、泳動度u(遷移率):

帶電質(zhì)點在單位強(qiáng)度電場下的泳動速度不同分子在同一電場中可能具有不同的泳動度泳動度與帶電顆粒所帶凈電荷的數(shù)量、顆粒大小和形狀有關(guān)。被分離的球形分子在電場中所受的力(F)為：

F=EQ式中E：電場強(qiáng)度，即每厘米支持物的電位降；Q為被分離物所帶凈電荷。泳動度（二）、影響電泳速度的因素樣品本身：帶電量，分子大小，形狀電場強(qiáng)度：電壓緩沖液：成分，pH，離子強(qiáng)度支持介質(zhì)：電滲作用，吸附作用溫度

影響泳動度的因素

1．電場強(qiáng)度

是指每厘米的電位降，也稱電位梯度(電勢梯度)。電場強(qiáng)度越高，則帶電顆粒泳動越快。根據(jù)電場強(qiáng)度的不同，電泳可分為兩種。(1)常壓(100～500V)電泳

其電場強(qiáng)度為2～10V／cm。分離時間較長，從數(shù)小時到數(shù)十小時，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。(2)高壓(2000～10000V)電泳

其電場強(qiáng)度為50～200V／cm，電泳時間很短，有時只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等小分子物質(zhì)。

影響泳動度的因素2．溶液pH

溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定其所帶電荷的多少。對蛋白質(zhì)而言，溶液pH值離等電點(pI)越遠(yuǎn)，則顆粒所帶的凈電荷越多，泳動速度也越快；反之，則越慢。

影響泳動度的因素3．溶液的離子強(qiáng)度

緩沖液離子強(qiáng)度越高，則顆粒的電動電勢越小，泳動度也越小。一般最適合的離子強(qiáng)度在O.02～O.2之間。

影響泳動度的因素4．電滲

電泳緩沖液相對于固體支持物的移動稱電滲。如紙電泳時，濾紙吸附OH-帶負(fù)電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負(fù)極移動。

影響泳動度的因素5．溫度

電泳時會產(chǎn)生焦耳熱，使介質(zhì)黏度下降，分子運動加快，遷移率增加，同時溫度過高會使樣品中的生物大分子變性失活。因此電泳時，要控制電壓或電流，也可安裝冷卻散熱裝置。6．支持物

要求是均勻，吸附力和電滲小，機(jī)械性能好，便于染色或紫外光下檢測，故最好透明，無紫外吸收。三、電泳的分類按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、平板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；按分離原理分類移界電泳（movingboundaryEP）不同的離子成分在均一的緩沖液系統(tǒng)中分離成獨立的區(qū)帶，可以用染色等方法顯示出來，如果用光密度計掃描可得出—個個互相分離的峰;區(qū)帶電泳(zoneEP)只能起到部分分離的作用，如將濃度對距離作圖，則得出一個個臺階狀的圖形;等速電泳(isotachophoresis)在電泳達(dá)成平衡后，各區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，以等速移動。按濃度對距離作圖也是臺階狀，但不同于上述移界電泳，它的區(qū)帶沒有重疊，而是分別保持;等電聚焦

(isoelectricfocusing)由多種具有不同等電點的載體兩性電解質(zhì)在電場中自動形成pH梯度。被分離物則各自移動到其等電點而聚成很窄的區(qū)帶，分辨率很高。AB+BABAABBAABCCBA移界區(qū)帶ABC等速等電聚焦pH9876混合分立穩(wěn)態(tài)時毗鄰穩(wěn)態(tài)時分立靜止1.連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液的離子成分、PH、凝膠濃度、電位梯度都相同，帶電顆粒電泳時僅具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。2.不連續(xù)系統(tǒng)：

緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度、電位梯度不連續(xù)，帶電顆粒電泳時具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。根據(jù)操作方式分類分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。

分子量小，阻力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。電泳作用效應(yīng)㈠、凝膠電泳凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)瓊脂糖凝膠電泳1、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脫水—L—半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖。

瓊脂瓊脂糖瓊脂膠脫去SO42-丙酮酸酯基應(yīng)用由于孔徑大，對大多數(shù)蛋白來說，其分子篩作用微不足道。因此廣泛應(yīng)用于核酸的研究，分離范圍廣（200bp-50kb的DNA）.瓊脂凝膠電泳：常用pH6-9;離子強(qiáng)度0.02-0.05;硼酸鹽緩沖液和巴比妥緩沖液；濃度常用1%-1.5%。瓊脂凝膠電泳的優(yōu)點：近似自由界面;液固相間無明顯界面，電泳速度快;不吸收紫外線，可直接用紫外檢測儀測定;容易染色易洗脫.瓊脂糖凝膠電泳的基本操作１、配制緩沖液貯備液２、水平型瓊脂糖凝膠制備３、樣品的制備與點樣４、電泳５、染色６、樣品回收-紫外-+水平板式電泳槽垂直板式電泳槽﹢﹣﹣﹢在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）--ethidiumbromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系:共價閉環(huán)超螺旋結(jié)構(gòu)DNA>直線DNA>雙鏈環(huán)狀DNA2、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide

gelelectrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和

Weintraub．L建立。1964年，此法進(jìn)一步從理論和實驗技術(shù)上得到改進(jìn)并推廣應(yīng)用。由于具有較高的分辨率和靈活性，目前已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離和分析。

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）原理PAGE是根據(jù)被分離物質(zhì)所帶電荷的多少及其分子大小、形狀不同，在電場作用下產(chǎn)生不同的移動速度而分離。它具有電泳和分子篩雙重作用.

聚丙烯酰胺凝膠構(gòu)成聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑

N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過硫酸銨(AP)或核黃素(C17H2O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)?！瞿z的聚合反應(yīng)：Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)過硫酸銨

Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst):四乙基乙二胺自由基的生成者凝膠的基本單位:丙烯酰胺交聯(lián)使聚合產(chǎn)生分枝:甲叉丙烯酰胺幫助傳遞自由基的催化劑Acrylamide

有毒性！-(OS-SO)442-2SO4CH2=CH-CO-NH212112核黃素-TEMED系統(tǒng)與過硫酸銨-TEMED系統(tǒng)■

聯(lián)丙烯酰胺單體聚合過程：聚合反應(yīng)交聯(lián)劑造成分枝端點自由基可再延續(xù)freeradicalBisBis聚合反應(yīng)交錯連結(jié)丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝膠具有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。如果形成的孔徑大小接近于所分離樣品分子的平均半徑，樣品分子在通過凝膠孔洞時，所受到的阻力就會和樣品分子的大小及形狀有關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點①在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；②化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；③對pH和溫度變化較穩(wěn)定；④幾乎無電滲作用；⑤樣品不易擴(kuò)散，其靈敏度可達(dá)10-6g；⑥凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)；⑦分辨率高；PAGE應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定相對分子質(zhì)量、等電點等。一些概念凝膠濃度和交聯(lián)度不連續(xù)膠與連續(xù)膠變性膠及非變性膠SDS(Sodiumdodecylsulfate)十二烷基磺酸鈉凝膠的濃度和交聯(lián)度凝膠濃度：T（Acr和Bis總濃度）=(a+b)/m.100%交聯(lián)百分比：C（交聯(lián)劑的百分比）=b/(a+b).100%a:Acr濃度；b:Bis濃度；m:緩沖液體積凝膠的濃度和交聯(lián)度濃度和交聯(lián)劑濃度決定膠的物理狀態(tài)及分子篩的孔徑的大小一般濃縮膠：2-5%，a:b=20分離膠：7-10%，a:b=40標(biāo)準(zhǔn)膠濃度：7%在濃度為7.5%

的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%

凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對于一個未知樣品，常用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10%

的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。連續(xù)膠與不連續(xù)膠:連續(xù)膠：膠條(膠板)的濃度、pH值、組成成份不變不連續(xù)膠:膠條(膠板)的濃度、pH值、組成成份變化連續(xù)膠的制膠過程與點樣過程玻璃板

(前,后)樣本梳間隔條間隔條濃縮膠分離膠不連續(xù)膠的制膠過程與點樣過程玻璃板

(前,后)樣本梳間隔條間隔條■

電泳凝膠系統(tǒng)的組成：1電泳系統(tǒng)pH膠體濃度緩沖液上層

(負(fù)極)緩沖液

2樣品溶液

3濃縮膠

6.9

4分離膠

膠體

5下層

(正極)緩沖液

Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-glycine

Tris-glycine

8.3

8.3

8.3

8.3

5%

7.5~20%

-

-

-

●

不連續(xù)膠有聚焦樣品的作用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理三種物理效應(yīng)

⑴樣品濃縮效應(yīng)

⑵分子篩效應(yīng)⑶電荷效應(yīng)三種物理效率使樣品分離效果好，分辨率高（1）樣品濃縮效應(yīng)：由凝膠系統(tǒng)的不連續(xù)性產(chǎn)生。

①凝膠孔徑不連續(xù)性②緩沖液離子成份的不連續(xù)性

③pH的不連續(xù)性

⑴．樣品濃縮效應(yīng)

凝膠孔徑的不連續(xù)性

樣品膠及濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶?！鰸饪s膠對蛋白質(zhì)分子的集焦作用：分離膠濃縮膠樣本8.96.9離子缺乏空間ABC++8.3

⑵．分子篩效應(yīng)

大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。蛋白質(zhì)進(jìn)入pH8.9的同一孔徑的分離膠后，分子小且為球狀的蛋白質(zhì)分子所受阻力小，移動快，走在前面；反之，則阻力大，移動慢，走在后面，從而通過凝膠的分子篩作用將各種蛋白質(zhì)分成各自的區(qū)帶。這種分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng)，后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子后流出。圖中圓球分別代表大、中、小3種不同分子量的蛋白質(zhì)。大、中、小分子分別滯留在與分子大小相當(dāng)?shù)哪z孔徑中，不再前進(jìn)，因而分離成3個區(qū)帶。

⑶．電荷效應(yīng)

在pH8.9的分離膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，則遷移快；反之，則慢。因此，各種蛋白質(zhì)按電荷多少、相對分子質(zhì)量及形狀，以一定順序排成一個個區(qū)帶，因而稱為區(qū)帶電泳。變性膠與非變性膠：變性膠：膠電泳在蛋白質(zhì)變性的狀態(tài)下進(jìn)行，主要指SDS變性條件下進(jìn)行；非變性膠：電泳在蛋白質(zhì)保持天然狀態(tài)下進(jìn)行，不加變性劑。

3、SDS電泳SDS即十二烷基硫酸鈉(SodiumDodecylSulfate，簡稱SDS)是陰離子表面活性劑，它能以一定的比例和蛋白質(zhì)結(jié)合，形成一種SDS--蛋白質(zhì)復(fù)合物。此復(fù)合物可用具有SDS的聚丙烯酰胺凝膠(包括連續(xù)的和不連續(xù)的系統(tǒng))電泳進(jìn)行分離，通常把這種電泳稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(簡稱SDS)。它的主要用途是分離蛋白質(zhì)和測定其分子量。⑴.SDS原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳能有效地把不同類型的蛋白質(zhì)分開的主要依據(jù)，是樣品中各種物質(zhì)的電荷和分子量的差異性。而SDS—PAGE的主要依據(jù)，則是各種物質(zhì)分子量的差異性。因為當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子問的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質(zhì)在SDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS一蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時產(chǎn)生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。SDS與PAGE有什么區(qū)別？SDS（十二烷基磺酸鈉）+蛋白線性復(fù)合物使復(fù)合物所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)超過天然蛋白本身電荷，消除了電荷效應(yīng)，而分子量占主導(dǎo)。H-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-O-S-O-Na+HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHOONon-polarHydrophobictailHydrophilicheadSDS（C12H25NaO4S）

SodiumDodecylSulfate十二烷基磺酸鈉

SDS是一種陰離子去污劑，它在水溶液中以單體和分子團(tuán)的混合形式存在。這種陰離子去污劑能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原劑打開并不易再氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合從而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。SDSProteinSDSandProteins

蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，所帶上的SDS負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而也就掩蓋或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。

這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在SDS聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率便不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀等因素的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)分子量大小。SDSXYZ+SDSNativeSDS分子量及凈電荷密度均影響泳動率只有分子量

影響泳動率XYZ-+-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）緩沖液樣品緩沖液凝膠緩沖液電泳緩沖液1xSDS:50mmol/LTris-Hcl(PH6.8)100mmol/LDTT2%SDS0.1%溴酚藍(lán)10%甘油Tris

堿用鹽酸一次調(diào)PH成功0.1%SDS1xTris–甘氨酸:25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸(PH8.3)0.1%SDS主要試劑及相關(guān)問題：1、Acr

和Bis

比例29：1，此時分辨率最佳，凝膠成透明；避光室溫保存，隔幾個月重配。2、SDS

電泳級10%母液，室溫儲備。3、分離膠、濃縮膠的Tris

緩沖液

PH6.8PH8.8神經(jīng)毒?。?！刺激呼吸系統(tǒng)?。≈饕噭┘跋嚓P(guān)問題：4、TEMED(四甲基乙二胺)

通過催化過硫酸銨形成自由基，加速Acr-Bis

聚合。低PH聚合反應(yīng)受到抑制。5、過硫酸銨提供引發(fā)聚合反應(yīng)的自由基。10%4℃保存.6、Tris-GlyBuffer吸入致命、揮發(fā)性強(qiáng)極其易燃，周圍不得有明火?。?！每周新配?。“踩?！凝膠濃度及其分離范圍丙烯酰胺濃度線性分離范圍/kDa1512107.55.010-4312-6020-8036-9457-212SDS電泳裝置實驗步驟安裝玻璃板灌注分離膠加水膜約30min后，膠凝聚后用水清洗幾遍！并吸干殘存的液體灌注濃縮膠灌滿！根據(jù)需要插入不同的梳子30min左右加電泳緩沖液，再拔梳子！拔梳子后形成點樣孔孔周圍有膜，用針撥開點樣，電泳-+蛋白質(zhì)電泳中SDS凝膠檢測常采用的染色方法有:考馬斯亮藍(lán)、硝酸銀染色、熒光染色法。染色液配制：

0.1%考馬斯亮藍(lán)R250(先用甲醇充分溶解)50%甲醇

10%冰乙酸

40%蒸餾水濾紙過濾脫色液配制：

10%甲醇

10%冰乙酸

80%蒸餾水5倍體積染色4小時以上，脫色搖床，中間更換幾次脫色液硝酸銀染色銀染的機(jī)制:來源于攝影銀染技術(shù),是將蛋白分子結(jié)合的銀離子還原作成金屬銀。優(yōu)點:檢測靈敏度高,較普通考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度要高50-100倍,可在蛋白質(zhì)中找到含量較低的蛋白,而且所需的上樣量較少(每點僅需0.1ｎｇ)。缺點:可重復(fù)性差耗費人力質(zhì)譜測定有一定的干擾

在某一PH下，蛋白質(zhì)分子在電場中不再移動，即靜電荷為零，則此PH值即為該蛋白質(zhì)的等電點。4、等電聚焦

聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(IsoelectricFocusing，簡稱IEF)：利用各種蛋白質(zhì)pI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)，兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。在電場作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時，就不再泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。PI2

PI3

PI1

++-+++--+---PH增加+_蛋白質(zhì)123蛋白質(zhì)在電場中，等點聚焦示意圖電泳系統(tǒng)中加進(jìn)兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通已直流電時，兩性電解質(zhì)載體即形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度。Pr進(jìn)入時，不同的Pr移動到與其等電點相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點的Pr得以分離。優(yōu)點：分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測定Pr或多肽的等電點。缺點：需無鹽溶液，不適用于在等電點不溶解或發(fā)生變性的Pr。第二向根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小不同在垂直方向或水平方向進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS)5、雙向電泳第一向根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同在PH梯度膠中等點聚焦（isoelectricfocusing,IEF)蛋白質(zhì)雙向電泳中SDS凝膠檢測常采用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)、硝酸銀染色、熒光染色法、免疫染色法以及蛋白質(zhì)印跡法。

染色6、變性梯度凝膠電泳變性梯度凝膠電泳（denaturinggelgradientelectrophoresis，DGGE）溫度梯度凝膠電泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）恒定變性膠電泳（Constantderatararedgelelectrophoresis，CDGE）分離原理：DGGE、CGGE及TGGE三種方法是基于相同的原理而設(shè)計的突變檢測方法，它仍均是根據(jù)DNA的解鏈特性而設(shè)計。對于同一定序列組成或的DNA片段來說，它具有恒定的解鏈溫度（Tm），但若其序列發(fā)生改變時，Tm值亦發(fā)生改變，在含有變性因素（變性劑，高溫）的凝膠中進(jìn)行電泳，當(dāng)其比鏈解開形成分叉時，電泳遷移的速度就會改變。Tm值主要取決于DNA的堿基組成，序列中出現(xiàn)單堿基替換時，Tm亦發(fā)生改變，電泳遷移率亦改變，此即DGGE、CDGE及TGGE鑒定突變的技術(shù)基礎(chǔ)。四、電泳技術(shù)問題及對策低離子溶液中,不同電荷的蛋白質(zhì)分子間會發(fā)生相互靜電作用.增加溶液離子強(qiáng)度可減少這種作用,但會提高電泳時的電流,使產(chǎn)熱更多,溫度升高又促進(jìn)蛋白質(zhì)的擴(kuò)散,使區(qū)帶變寬,分辨率下降.因此電泳緩沖液的離子強(qiáng)度必須控制適當(dāng).0.02-0