基因工程原理第4章質(zhì)粒和噬菌體載體的基礎(chǔ)生物學(xué)

1思考題什么是基因工程？你對(duì)轉(zhuǎn)基因有何看法？發(fā)揮想象力，開發(fā)一種基因工程產(chǎn)品。主題報(bào)告重組DNA技術(shù)的應(yīng)用全班同學(xué)分為六個(gè)小組：六個(gè)主題，可以突破，自己選題，保證與基因工程相關(guān)班長(zhǎng)負(fù)責(zé)分組，安排報(bào)告時(shí)間，從第14周開始。23第四章質(zhì)粒和噬菌體載體的基礎(chǔ)生物學(xué)第一節(jié)質(zhì)粒生物學(xué)質(zhì)粒是在染色體外穩(wěn)定遺傳的復(fù)制體大多數(shù)質(zhì)粒是以雙鏈環(huán)狀DNA分子的形式存在共價(jià)閉環(huán)DNA,cccDNA開環(huán)DNA,ocDNA45線性超螺旋開環(huán)質(zhì)粒電泳圖譜6質(zhì)粒酶切圖譜7溴化乙錠影響質(zhì)粒的超螺旋8并不是所有質(zhì)粒都是環(huán)狀分子在多種細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)有線性質(zhì)粒線性質(zhì)粒的末端保護(hù)機(jī)制：在末端DNA發(fā)卡環(huán)中以重復(fù)序列結(jié)尾通過(guò)共價(jià)結(jié)合蛋白來(lái)保護(hù)末端9質(zhì)粒所攜帶基因的表型特征10質(zhì)粒的分類接合型和非接合型依據(jù)是否攜帶有一套促進(jìn)細(xì)菌接合的轉(zhuǎn)移基因（tra基因）松弛型和嚴(yán)謹(jǐn)型取決于單個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)1112質(zhì)粒的宿主范圍由它的ori區(qū)域決定嚴(yán)格的宿主范圍：如ColE1提供的ori的質(zhì)粒只能在腸細(xì)菌中復(fù)制廣宿主范圍：復(fù)制所需的蛋白質(zhì)大部分甚至全部都是自己編碼的13質(zhì)粒的拷貝數(shù)通過(guò)調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制的起始來(lái)決定。兩種調(diào)控機(jī)制：通過(guò)反義RNA調(diào)控（RNAII和RNAI）通過(guò)關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)結(jié)合來(lái)進(jìn)行調(diào)控

Rop促進(jìn)RNAI和RNAII的配對(duì)

RepA蛋白14ColE1衍生質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控15pSC101的ori區(qū)域RepA蛋白由質(zhì)粒編碼，可以與ori區(qū)域的重復(fù)區(qū)結(jié)合，抑制DNA的合成。RepA蛋白通過(guò)與自身啟動(dòng)子結(jié)合，阻斷自身基因轉(zhuǎn)錄，抑制自身合成。RepA蛋白通過(guò)結(jié)合兩個(gè)質(zhì)粒的重復(fù)區(qū)序列把它們連接起來(lái)，這樣避免它們起始復(fù)制。（手銬機(jī)制）1617質(zhì)粒的分配和分離穩(wěn)定性人們把由于錯(cuò)誤的分配而造成的質(zhì)粒丟失稱為分離不穩(wěn)定性。Par分配機(jī)制涉及DNA的超旋性質(zhì)粒形成多聚體18質(zhì)粒的不相容性在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種質(zhì)粒不能共存于同一個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)。如果質(zhì)粒擁有相同的復(fù)制調(diào)控機(jī)制，它們就不相容。19第二節(jié)質(zhì)粒DNA的純化Vinograd的經(jīng)典方法：CsCl，EtBr密度梯度離心Binrnboim和Doly：堿裂解法20CsCl，EtBr密度梯度離心21堿裂解法NaOH和SDS裂解乙酸鈉中和離心，取上清沉淀TER消化RNA沉淀，75%乙醇洗干燥、溶解22質(zhì)粒產(chǎn)量的影響因素細(xì)胞收獲時(shí)的拷貝數(shù)制備清亮裂解液宿主細(xì)胞中野生型endA基因23質(zhì)?？寺≥d體的理想特性相對(duì)分子量小(易于操作、拷貝數(shù)高、利于出現(xiàn)單一酶切位點(diǎn))可以在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生便于選擇的表型特性(便于篩選)存在多種限制性酶的單一位點(diǎn)區(qū)域，且最好位于易測(cè)表型基因上(便于克隆、篩選）pBR322載體25pBR322的限制圖譜262728pBR322衍生出更好的載體29pUC8質(zhì)粒衍生自pBR322含有復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)和另兩個(gè)基因：氨芐青霉素抗性基因和lacZ’基因30Lac篩選(藍(lán)白斑篩選)pUC質(zhì)粒含LacZ基因，該酶能分解生色底物X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入LacZ基因后失活，菌株呈白色，稱之為藍(lán)白斑篩選。31pUC8等大腸桿菌質(zhì)粒的缺點(diǎn)不能操作大于10kb的DNA片段大片段的插入會(huì)引起重組或干擾質(zhì)粒的復(fù)制體系，且重組DNA分子在宿主細(xì)胞中丟失32第三節(jié)λ噬菌體線性的雙螺旋分子，大約長(zhǎng)48.5kb每個(gè)末端都有短的12個(gè)核苷酸的單鏈5’突出，它們?cè)谛蛄猩匣パa(bǔ)，進(jìn)入宿主細(xì)胞后形成環(huán)形結(jié)構(gòu)33λ噬菌體的基因組34λ噬菌體非必須DNAλ噬菌體基因組大小為48.5kb，其中有15kb只在噬菌體DNA整合到大腸桿菌染色體過(guò)程(即溶源性感染周期)中必須，該片段的刪除不影響噬菌體感染細(xì)菌的能力，也不影響裂解周期中新的λ噬菌體顆粒合成，稱為隨意DNA。35λ噬菌體的生活周期36λ噬菌體裂解性感染周期與溶源性感染周期為了能夠復(fù)制，噬菌體必須進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞并促使細(xì)菌的酶表達(dá)噬菌體基因所包含的信息，以便于細(xì)菌能合成新的噬菌體。一旦復(fù)制完成，新的噬菌體便離開細(xì)菌，并通常引起細(xì)菌死亡，并繼續(xù)感染新的細(xì)胞，這稱為裂解性感染周期。λ噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體上，保持多代的休眠狀態(tài)，并隨細(xì)胞分裂而與宿主染色體一起復(fù)制，稱為溶源性感染周期。3738λ噬菌體的主要啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)λ噬菌體載體插入型載體(insertionvector)，部分或全部隨意DNA被刪除，并在刪除后的基因組內(nèi)部某位點(diǎn)引入單一的限制性酶切位點(diǎn)。取代型載體(replacementvector)，隨意DNA兩側(cè)引入限制性酶切位點(diǎn)，用需克隆的DNA在連入時(shí)替代隨意DNA。39噬菌體λ克隆載體EMBL3

和EMBL4的結(jié)構(gòu)40λ噬菌體的體外包裝4142混合裂解液中串聯(lián)噬菌體λDNA的體外包裝43用單鏈DNA載體進(jìn)行DNA克隆M13、f1和fd是包含一個(gè)環(huán)形的單鏈DNA分子的絲狀大腸桿菌噬菌體。