毛細管電泳(劉志廣版本)

第十一章

高效毛細管電泳分析一、概述generalization二、經典電泳分析法traditionalelectrophoresis三、高效毛細管電泳分析法highperformancecapillaryelectrophoresis第一節(jié)

概述generalizationHighperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE2023/2/6一、概述generalization

在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同，可實現分離。

1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；

發(fā)現樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學獎；（動畫）2023/2/6二、經典電泳分析

traditionalelectrophoresis

利用電泳現象對某些化學或生物物質進行分離分析的方法和技術叫電泳法或電泳技術。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術——高效毛細管電泳。2023/2/6三、高效毛細管電泳分析

highperformancecapillaryelectrophoresis高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進：

一是采用了0.05mm內徑的毛細管,；二是采用了高達數千伏的電壓。毛細管的采用使產生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數百萬。2023/2/6分離過程

電場作用下，毛細管柱中出現：電泳現象和電滲流現象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；

中性粒子無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反。ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。（動畫）2023/2/6高效毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化

電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內分離36種無機及有機陰離子，4.1min內分離了24種陽離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數；3.操作方便、消耗少

進樣量極少，水介質中進行；4.應用范圍極廣有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學、醫(yī)學、藥學、化學、環(huán)境保護、材料等；

2023/2/6內容選擇結束第一節(jié)概述generalization第二節(jié)高效毛細管電泳的理論基礎basictheoryofHPCE第三節(jié)高效毛細管電泳儀器highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus第四節(jié)高效毛細管電泳的分離模式separatetypesofHPCE第五節(jié)應用與進展applicationandadvancesofHPCE2023/2/6第十一章

高效毛細管電泳分析法一、PHCE基本原理basicprinciplesofPHCE二、電滲現象與電滲流electroosmosisandelectroosmoticflow三、影響電滲流的因素factorsinfluencedelectroosmosis四、淌度mobility五、PHCE中的參數與關系式parametersandrelationinHPCE六、影響分離效率的因素factorsinfluencedseparationefficiency第二節(jié)

高效毛細管電泳理論基礎highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEbasictheoryofHPCE2023/2/6一、高效毛細管電泳(HPCE)基本原理

basicprinciplesofPHCE

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關？當帶電離子以速度ν

在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(對于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態(tài)動力學半徑；η—介質的粘度；)2023/2/6所以，遷移速度：（球形離子）

物質離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。淌度μ

：單位電場強度下的平均電泳速度。

2023/2/6二、電滲現象與電滲流

electroosmosisandelectroosmoticflow1.電滲流現象

當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現象叫電滲現象。

電滲現象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

2023/2/62.HPCE中的電滲現象與電滲流

石英毛細管柱，內充液pH>3時，表面電離成-SiO-,管內壁帶負電荷，形成雙電層。

在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度ν電滲流。2023/2/63.HPCE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。即

ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質及雙電層的Zeta電勢，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數；ε—介電常數；ξ—毛細管壁的Zeta電勢。

ν電滲流=ε0εξ

E實際電泳分析，可在實驗測定相應參數后，按下式計算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細管有效長度；teo—電滲流標記物（中性物質）的遷移時間。2023/2/6HPCE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的性質：內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內表面帶正負電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極；石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：

（1）毛細管改性表面鍵合陽離子基團；

（2）加電滲流反轉劑內充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。2023/2/64.HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小）；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。2023/2/65.HPCE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；

ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；

ν0=ν電滲流中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結果的重現性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。2023/2/6三、HPCE中影響電滲流的因素

factorsinfluencedelectroosmosis1.電場強度的影響

電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細管材料的影響

不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產生的電滲流大小不同；2023/2/63.電解質溶液性質的影響（1）溶液pH的影響

對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。2023/2/62023/2/64.溫度的影響

毛細管內溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產生的熱量；

HPCE中的焦耳熱與背景電解質的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質溶液黏度變化2%～3%；2023/2/65.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；（3）加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。2023/2/6四、淌度mobility

淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；

淌度不同是電泳分離的基礎。1.絕對淌度(absolutemobility)μab無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強度下的平均遷移速度，簡稱淌度?？稍谑謨灾胁殚?。2.有效淌度(effectivemobility)μef實際溶液中的淌度(實驗中測定的)。μef=∑aiμi

ai—溶質i的解離度；μi—溶質i在解離狀態(tài)下的絕對淌度3.表觀淌度

μap離子在實際分離過程中的遷移速度（表觀遷移速度）：

νap=μapE2023/2/6五、HPCE中的參數與關系式

parametersandrelationinHPCE1.遷移時間（保留時間）

HPCE兼具有電化學的特性和色譜分析的特性。有關色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細管總長度；2.分離效率（塔板數）

在HPCE中，僅存在縱向擴散，σ2=2Dt

擴散系數小的溶質比擴散系數大的分離效率高，分離生物大分子的依據。2023/2/63.分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計算：2023/2/6六、影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬

factorsinfluencedtheefficiency—bandbroadening

1.縱向擴散的影響

在HPCE中，縱向擴散引起的峰展寬：σ2=2Dt由擴散系數和遷移時間決定。大分子的擴散系數小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據。2.進樣的影響

當進樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向擴散。分離效率明顯下降；理想情況下，進樣塞長度：

Winj=(24Dt)1/2實際操作時進樣塞長度小于或等于毛細管總長度的1%～2%。2023/2/63.焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產生的焦耳熱可由下式計算：m—電解質溶液的摩爾電導；I—工作電流：cm—電解質濃度；

散熱過程中，在毛細管內形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導致區(qū)帶展寬。改善方法：（1）減小毛細管內徑；（2）控制散熱；2023/2/64.溶質與管壁間的相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質、多肽帶電荷數多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴重，是目前分離分析該類物質的一大難題。細內徑毛細管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質吸附的機會。減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強電解質，兩性離子一端帶正電，另一端帶負電，帶正電一端與管壁負電中心作用，濃度約為溶質的100-1000倍時，抑制對蛋白質吸附，又不增加溶液電導，對電滲流影響不大。2023/2/65.其他影響因素

（1）電分散作用對譜帶展寬的影響當溶質區(qū)帶與緩沖溶液區(qū)帶的電導不同時，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質溶液。（2）“層流”現象對譜帶展寬的影響一般情況下，HPCE中不存在層流，但當毛細管兩端存在壓力差時，出現拋物線形的層流；

產生的原因：毛細管兩端液面高度不同。實際操作時，保持毛細管兩端緩沖溶液平面高度相同。2023/2/6請選擇內容第一節(jié)概述generalization第二節(jié)高效毛細管電泳的理論基礎basictheoryofHPCE第三節(jié)高效毛細管電泳儀器highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus第四節(jié)高效毛細管電泳的分離模式separatetypesofHPCE第五節(jié)應用與進展applicationandadvancesofHPCE結束2023/2/6第十一章

高效毛細管電泳分析法一、高效毛細管電泳儀highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus二、流程與主要部件processandmainassembly三、進樣方式injectionmethod第三節(jié)

高效毛細管電泳儀highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEhighperformancecapillaryelectrophoresisapparatus2023/2/6一、高效毛細管電泳儀

highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus2023/2/6儀器22023/2/6儀器32023/2/6二、儀器流程與主要部件

processandmainassembly

電壓：0～30kV；

分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21

mol/L）2023/2/61.高壓電源（1）0～30

kV穩(wěn)定、連續(xù)可調的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉換；2.毛細管柱

（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差；（2）規(guī)格：內徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m2023/2/63.緩沖液池

化學惰性，機械穩(wěn)定性好；4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數據采集與計算機數據處理一體化；

類型檢測限/mol特點紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；2023/2/6三、毛細管電泳的進樣方式

injectionmethodof

HPCE進樣量：毛細管長度的1%-2%；納升級、非常小；1.流體力學進樣方式

（1）進樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進樣2023/2/6

毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進樣方式

進樣不均：電歧視現象，淌度大的離子比淌度大的進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；

特別適合黏度大的試樣；3.擴散進樣試樣通過擴散作用進入分離柱端口處。2023/2/6內容選擇結束第一節(jié)概述generalization第二節(jié)高效毛細管電泳的理論基礎basictheoryofHPCE第三節(jié)高效毛細管電泳儀器highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus第四節(jié)高效毛細管電泳的分離模式separatetypesofHPCE第五節(jié)應用與進展applicationsandadvancesofHPCE2023/2/6第十一章

高效毛細管電泳分析法一、毛細管區(qū)帶電泳(CZE)capillaryzoneelectrophoresis二、毛細管凝膠電泳(CZE)capillarygelelectrophoresis三、膠束電動毛細管色譜micelleelectrokineticcapillaryelectrophoresis四、毛細管等電聚焦(CIEF)capillaryisoelectricfocusing五、毛細管等速電泳capillaryisotachophoresis第四節(jié)

高效毛細管電泳分離模式highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEseparatetypesofHPCE

2023/2/6分離類型八種分離類型，介紹常用的幾種；根據試樣性質不同，采用不同的分離類型；每種機理的選擇性不同；2023/2/6一、毛細管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應用廣的分離模式；2023/2/6二、毛細管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE

將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質、DNA等的電荷/質量比與分子大小無關，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。2023/2/6

1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。三、膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）

micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。2023/2/6

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；

5.色譜與電泳分離模式的結合。3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長；4.可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；2023/2/6

1.根據等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術；2.毛細管內充有兩性電解質（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（6～8V）時，管內將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；四、毛細管等電聚焦

capillaryisoelectricfocusing，CIEF2023/2/6

4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質帶而相互分離；

5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細管內分離后的溶液推出經過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。2023/2/6

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2.負離子分析時，前導電解質的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區(qū)帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。五、毛細管等速電泳

capillaryisotachophoresis，CITP2023/2/6

3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同(ν=μE)，淌度大的離子區(qū)帶電場強度??；沿出口到進口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4電場強度依次增大。假設“2”號中離子擴散到“3”號，該區(qū)電場強度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊；4.特點：界面明顯，富集、濃縮作用；capillaryisotachophoresis，CITP2023/2/6

在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以電滲流為流動相，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程；六、毛細管電滲色譜

capillaryelectroosmosticchromatography，CEC2023/2/6請選擇內容第一節(jié)概述generalization第二節(jié)高效毛細管電泳的理論基礎basictheoryofHPCE第三節(jié)高效毛細管電泳儀器highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus第四節(jié)高效毛細管電泳的分離模式separatetypesofHPCE第五節(jié)應用與進展applicationandadvancesofHPCE結束2023/2/6第十一章

高效毛細管電泳分析法一、離子分析analysisofion二、藥物分析analysisofpharmaceutics三、手性化合物分析analysisofchiralcompounds四、氨基酸分析analysisofaminoacids五、核酸分析及DNA測序analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA六、新進展及熱點問題advancesandspecialtopics第五節(jié)

高效毛細管電泳應用與進展highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCEapplicationandadvancesofHPCE2023/2/6一、離子分析

analysisofion陽離子分析

遷移方向和電滲流方向一致；4.5min內分離了24種金屬離子；陽極進樣，陰極檢測；具有很高的靈敏度；2023/2/6陰離子分析陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時間長、效率低；質量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測；加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化