酵母菌的基因工程課件

5.2酵母菌的基因工程發(fā)展歷程1974年rlarck—walker和Miklos發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)釀酒酵母中存在質(zhì)粒。1978年Hmnen將來自一株釀酒酵母的leu2基因?qū)肓硪恢赆劸平湍?，彌補(bǔ)了后者的Leu2缺陷，標(biāo)志著酵母表達(dá)系統(tǒng)的建立。1981年Hinnen等用酵母基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了人干擾素。我國也在1983年首次用酵母菌表達(dá)了乙型肝炎病毒表面抗原基因。1996年在全世界科學(xué)家的通力合作下，完成了第一個(gè)真核生物——釀酒酵母全基因組的測序。酵母菌是外源基因最成功的真核生物表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢在于：安全無毒，不致??；有較清楚的遺傳背景，容易進(jìn)行遺傳操作；容易進(jìn)行載體DNA的導(dǎo)入。DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷發(fā)展優(yōu)化，多數(shù)酵母菌可以取得較高的轉(zhuǎn)化率；培養(yǎng)條件簡單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵；5.能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中；有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能。缺陷在于：表達(dá)效率相對低2.酵母常有密碼子偏性，真核基因在其中表達(dá)時(shí)需要人工修正。廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達(dá)的研究的酵母菌包括：酵母屬如釀酒酵母克魯維酵母屬如乳酸克魯維酵母畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母裂殖酵母屬如非洲酒裂殖酵母漢遜酵母屬如多態(tài)漢遜酵母其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想提高重組異源蛋白產(chǎn)率的誘變宿主菌使啤酒酵母中異源蛋白產(chǎn)量提高和質(zhì)量改善的突變突變產(chǎn)生的異源蛋白增加產(chǎn)量（倍數(shù)）作用位點(diǎn)SSC1凝乳酶原Ca2+-ATPase牛生長因子3-10轉(zhuǎn)錄后SSC2凝乳酶原轉(zhuǎn)錄后牛生長因子rgrl鼠α—淀粉酶5-10轉(zhuǎn)錄后oselβ—內(nèi)啡肽7-12轉(zhuǎn)錄后NDS人血清蛋白溶酶原活化劑抑制因子2型10轉(zhuǎn)錄ss1lα1—抗胰蛋白酶P人溶菌酶10羧肽酶Yrho人溶菌酶10轉(zhuǎn)錄人表皮因子NDE抑制超糖基化作用的突變宿主菌

許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天門冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個(gè)糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。

突變類型生物效應(yīng)mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷och外側(cè)糖鏈添加缺陷型酵母菌普遍擁有完整的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。減少泛蛋白因子依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌

泛素降解途徑衰減的釀酒酵母UBI4缺陷型：在釀酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表達(dá)，UBI4-突變株正常生長，但細(xì)胞內(nèi)游離泛素分子的濃度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突變株是外源基因表達(dá)理想的受體。UBA1缺陷型：UBA1編碼泛素激活酶E1，UBA1突變株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介導(dǎo)的蛋白降解。Ubc4-ubc5雙突變型：七個(gè)泛素連接酶基因的突變對衰減蛋白降解作用同樣有效。5.2.2酵母菌的載體系統(tǒng)載體的一般結(jié)構(gòu)選擇標(biāo)記復(fù)制子表達(dá)盒啟動子先導(dǎo)序列終止子有用的蛋白結(jié)構(gòu)域1酵母菌中的野生型質(zhì)粒2酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建酵母菌種的野生型質(zhì)粒釀酒酵母中的2μ環(huán)狀質(zhì)粒幾乎所有的釀酒酵母都含有2μ雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)維持50-100個(gè)。Irs反向重復(fù)序列600bp，重組FLP編碼產(chǎn)物驅(qū)動Irs的同源重組REP編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STBREP的結(jié)合位點(diǎn)接合酵母屬中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1以及克魯維酵母屬中的pKD1質(zhì)粒等，均有類似的結(jié)構(gòu)。酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有ARS的YRp和YEp質(zhì)粒及其構(gòu)建ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，大小在0.8-1.5Kb,染色體上每30-40bp就有一個(gè)ARS元件。由染色體ARS構(gòu)成的質(zhì)粒稱為Yrp，而由2μ質(zhì)粒構(gòu)建的雜合質(zhì)粒為Yep。上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個(gè)，但是經(jīng)過幾代培養(yǎng)后，質(zhì)粒丟失率達(dá)50%-70%，主要由于分配不均勻所致。酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有CEN的YCp質(zhì)粒的構(gòu)建CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列。將CEN插入到ARS質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp。YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)通常只有1-5個(gè)。酵母菌克隆表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建含有TEL的YAC質(zhì)粒的構(gòu)建利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件構(gòu)建人工酵母染色體，可以克隆擴(kuò)增大片段的外源DNA，這是構(gòu)建YAC載體的基本思路YAC載體的裝載量可高達(dá)800kb，適用于構(gòu)建人的基因組文庫。酵母菌的轉(zhuǎn)化程序酵母菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化法。在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)存活的原生質(zhì)球總數(shù)的1%-5%。但是操作周期長，而且轉(zhuǎn)化效率受到原生質(zhì)再生率的嚴(yán)重制約。原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法德一個(gè)顯著特點(diǎn)是，一個(gè)受體細(xì)胞可同時(shí)接納多個(gè)質(zhì)粒分子，而且這種共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%-33%。酵母菌的轉(zhuǎn)化程序堿金屬離子介導(dǎo)的酵母菌完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化釀酒酵母的堿金屬細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）、PEG熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA，而且具有以下特性：吸收吸收線性DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA，二者相差80倍。共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象較為罕見。酵母菌的轉(zhuǎn)化程序酵母菌電擊轉(zhuǎn)化酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA，但在此過程中應(yīng)避免使用PEG，它對受電擊的細(xì)胞具有較大的負(fù)作用。其優(yōu)勢在于不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件適用范圍廣，而且轉(zhuǎn)化率高達(dá)105轉(zhuǎn)化子/μgDNA。用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要由營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因兩大類。營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成記憶如：Leu、Trp、His、Lys、Ura、Ade。但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難。用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因顯性標(biāo)記基因顯性標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物只標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型Aph氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶抗G418Cat氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗氯霉素Dhfr二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺Cup1銅離子螯合物耐受銅離子Suc2蔗糖轉(zhuǎn)化酶耐受高濃度蔗糖Ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑5.2.4酵母菌的表達(dá)系統(tǒng)酵母菌啟動子的基本特征和選擇酵母菌啟動子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)外源基因在酵母菌中表達(dá)的限制因素酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇酵母菌啟動子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)

（1）溫度控制性啟動子釀酒酵母有a和α兩種單倍體，分別由MATa和MATα兩種等位基因決定。MATα由順反子MATα1和MATα2組成，前者決定α1的激活過程，后者決定α2阻遏過程。MATa中，a1和a2蛋白共同決定a1-a2阻遏。A25℃Sir3-8tsSir3-8tshmlα2-102α1a1MATaMATaa1hmlα2-102受體細(xì)胞基因組重組質(zhì)粒a型啟動子a型啟動子α型啟動子α型啟動子酵母菌啟動子的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)（2）超誘導(dǎo)型啟動子當(dāng)釀酒酵母生長在無半乳糖或葡萄糖存在的培養(yǎng)基時(shí)，其GAL1、GAL7、GAL10啟動子受到阻遏；加入半乳糖或者葡萄糖時(shí)，啟動子活性被誘導(dǎo)1000倍。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脫氫酶基因ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來彌補(bǔ)。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的搞笑表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌性的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬強(qiáng)啟動子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性事巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列一般整合入受體的染色體DNA上。在此情況下，外源基因的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)多型漢遜酵母也是一種甲基營養(yǎng)菌。其自主復(fù)制序列HARS已被克隆，并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體，但與巴斯德畢赤酵母相似，這種載體在受體細(xì)胞有絲分裂時(shí)顯示出不穩(wěn)定性。所不同的是，HARS質(zhì)粒能高頻自發(fā)地整合在受體的染色體DNA上，甚至可以連續(xù)整合100多個(gè)拷貝，因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。目前，包括乙型肝炎表賣弄抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。酵母菌的蛋白修飾分泌系統(tǒng)蛋白質(zhì)的分泌運(yùn)輸機(jī)制信號肽及其剪切系統(tǒng)分泌型蛋白的糖基化修飾蛋白質(zhì)的分泌運(yùn)輸機(jī)制

酵母菌的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)與其他高等真核生物相似，高度分化的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)在酵母菌蛋白分泌運(yùn)輸過程中起著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜核膜高爾基體泡囊質(zhì)膜信號肽及其剪切系統(tǒng)與其他真核生物相似，酵母菌信號肽序列的保守性較低，大都由15-30個(gè)氨基酸殘基組成，含有三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)特征，即N端帶正電荷的n區(qū)，中間疏水殘基的h區(qū)，C端極性的c區(qū)。n區(qū)的長度及氨基酸殘基性質(zhì)各異，都含正電荷。h區(qū)的疏水氨基酸殘基大都隨即排列。c區(qū)具有對應(yīng)于信號肽剪切位點(diǎn)的特征序列。分泌型蛋白的糖基化修飾酵母菌中的蛋白質(zhì)糖基化修飾有兩個(gè)主要步驟，即在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中的寡聚多糖核裝配以及在高爾基體中的糖外鏈延伸。進(jìn)入高爾基體的分泌型蛋白在其寡聚多糖核上進(jìn)行外鏈的延伸反應(yīng)。酵母菌的修飾形式不同于高等真核生物。重組異源蛋白在酵母菌受體細(xì)胞中的超糖基化會造成重組蛋白的生物活性降低以及蛋白質(zhì)的免疫原性增加等。利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗乙肝肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，具有感染能力的病毒顆粒，直徑42nm，基因組僅為3.2kb。病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白石病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式，顆粒內(nèi)的蛋白成分包括核心抗原、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母20世紀(jì)80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中