染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用

染色體微陣列的原理與臨床應(yīng)用第一頁，共七十二頁，2022年，8月28日一.出生缺陷概念及概況二.遺傳病常見診斷方法及比較三.染色體微陣列技術(shù)臨床應(yīng)用四.病例分享五.染色體微陣列技術(shù)局限性、結(jié)果判讀及帶來的挑戰(zhàn)第二頁，共七十二頁，2022年，8月28日一.出生缺陷概念及概況第三頁，共七十二頁，2022年，8月28日出生缺陷也稱先天異常，是指由于遺傳因素、環(huán)境因素或兩者共同作用于孕前或孕期，引起胚胎或胎兒在發(fā)育過程中發(fā)生解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和/或功能上的異常。2012年衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)我國出生缺陷率達(dá)5.6%，每年新增出生缺陷患兒90-120萬例。隨著二胎政策的全面放開，孕婦年齡增加及環(huán)境因素影響，估計(jì)出生缺陷數(shù)量還會(huì)增加。保守估計(jì)，我國有上千萬的罕見病群體，幾乎無法得到有效診斷和治療，甚至遭到嚴(yán)重歧視。第四頁，共七十二頁，2022年，8月28日出生缺陷出生缺陷遺傳因素環(huán)境因素（理、化、生物因素、生活方式）遺傳+環(huán)境因素染色體異常（所有新生兒中，染色體異常占0.92%，多為新發(fā)而非遺傳）單基因突變（多為孟德爾遺傳，少數(shù)為新發(fā)）第五頁，共七十二頁，2022年，8月28日基因組：細(xì)胞核DNA成分和線粒體DNA分子的總和基因:基因組內(nèi)一個(gè)個(gè)具體的結(jié)構(gòu)和功能單位染色體：基因的載體細(xì)胞核DNA:46條染色體，30億個(gè)堿基，編碼21000個(gè)基因。線粒體DNA:雙鏈閉合環(huán)狀分子，16569個(gè)堿基，編碼37個(gè)基因，編碼2種rRNA、22種tRNA和13種氧化磷酸化相關(guān)蛋白。第六頁，共七十二頁，2022年，8月28日第七頁，共七十二頁，2022年，8月28日第八頁，共七十二頁，2022年，8月28日第九頁，共七十二頁，2022年，8月28日Progeriasyndrome

ApointmutationoftheLMNAgenelongevityMorethan150genespreventscholesterolbuildup第十頁，共七十二頁，2022年，8月28日

精確控制胚胎發(fā)育和分化的每一個(gè)步驟;決定了個(gè)體的所有生命特征;決定了個(gè)體患各種疾病的可能性.第十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日遺傳病：遺傳物質(zhì)發(fā)生突變所引起的疾病。種類：確定的遺傳疾病超過7000種。1、單基因病--涉及一對(duì)基因，AR、AD、XR、XD、Y連鎖遺傳病。隱性遺傳4000，顯性遺傳3000。

2、多基因病--多對(duì)基因和環(huán)境共同作用所導(dǎo)致的疾病。

3、染色體病--數(shù)目異常及結(jié)構(gòu)異常引起的疾病。4、體細(xì)胞遺傳病--體細(xì)胞突變?nèi)缒[瘤。5、線粒體病--線粒體功能異常為主要起因的一大類疾病。特征：垂直傳遞、終生性、發(fā)病率低、危害嚴(yán)重、家族性發(fā)病、多無有效治療。成為危害人類健康的主要疾病。遺傳病第十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日Genetic/GenomicDisordersGenomicdisorders(number)Trisomy21Trisomy18Trisomy13MosaictrisomiesofotherchromosomesGenomicdisorders(structure)Morethan400knowndisordersMonogenicdisordersDominant(4,000)Recessive(3,000)MultigenicdisordersGenes+Environments第十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日二.遺傳病常見診斷方法及比較第十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日遺傳病的診斷染色體核型分析Karyotyping熒光原位雜交

FluorescenceInSituHybridization(FISH)染色體微陣列技術(shù)Chromosomalmicroarrayanalysis(CMA)

測序技術(shù)First-generation-SangermethodNovelsequencingtechniques第十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日傳統(tǒng)核型分析技術(shù)除了染色體非整倍體，染色體微缺失和微重復(fù)等基因組失衡是導(dǎo)致胎兒發(fā)育遲緩、畸形和其他先天性疾病的主要原因。Structuralvariationinthehumangenomeanditsroleindisease[J].AnnuRevMed.2010,61:437-55第十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日第十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日是目前較為成熟的遺傳性疾病診斷技術(shù)傳統(tǒng)核型分析技術(shù)絨毛活檢取材孕中期羊膜腔穿刺羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析染色體數(shù)量變化、平衡、不平衡易位、轉(zhuǎn)位和顯微鏡下可見的大片段缺失和重復(fù)。

第十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日核型分析局限性材料受限，需要新鮮的組織、血樣進(jìn)行活細(xì)胞培養(yǎng)不能分辨長度在10Mb以下染色體片斷的缺失、重復(fù)或易位染色體亞端粒區(qū)域異常診斷率較低不能檢測LOH和UPD單細(xì)胞分析

高分辨率分析第十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日熒光原位雜交技術(shù)（fluorescentin-situhybridization，F(xiàn)ISH)可對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)的缺失、重復(fù)、易位及多倍體等染色體異常作出診斷提高了染色體異常的診斷精度FISH探針能同時(shí)與分裂期染色體或間期核染色絲特異雜交----無需細(xì)胞培養(yǎng)，可用于單細(xì)胞分析Chromosome13q13-14熒光標(biāo)記的DNA探針中期分裂相間期細(xì)胞核Chromosome21q21第二十頁，共七十二頁，2022年，8月28日FISH局限性只能檢測已知突變的疾病，對(duì)背景未知的基因引發(fā)的疾病無法檢測。不能分辨LOH和UPD一次最多只能檢測5-8個(gè)位點(diǎn)，無法進(jìn)行整個(gè)基因組的檢測，增加探針又會(huì)面臨準(zhǔn)確性下降的問題。對(duì)植入前胚胎的檢測，缺乏覆蓋全基因組檢測的能力第二十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體微陣列技術(shù)（chromosomalmicroarrayanalysis）微陣列比較基因組雜交(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)SNParray第二十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日微陣列比較基因組雜交技術(shù)

(arraycomparativegenomichybridization,aCGH)

aCGH技術(shù)圖示：正常對(duì)照樣品和患者樣品基因組DNA用兩種不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記（正常樣品用Cy3標(biāo)記呈現(xiàn)綠色，患者樣品用Cy5標(biāo)記呈現(xiàn)紅色）。綠色峰（Cy3）表明紅色信號(hào)缺失，與對(duì)照樣品相比患者DNA樣品發(fā)生缺失。相反如果Cy5信號(hào)增強(qiáng)顯示為紅色峰（紅色箭頭），表明患者DNA樣品特定基因組區(qū)域發(fā)生獲得。aCGH芯片能夠定位DNA拷貝數(shù)量變化在基因組的位置。第二十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日SNP芯片含有大量寡核苷酸探針，起初設(shè)計(jì)被用于檢測SNP等位基因。SNP芯片不僅能夠研究拷貝數(shù)變異（CNV），而且還能夠?qū)NP基因型進(jìn)行分析SNParray第二十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體微陣列(chromosomalmicroarrayanalysis,CMA)技術(shù)優(yōu)勢全基因組范圍內(nèi)同時(shí)檢測染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常如染色體微缺失(deletion)和微重復(fù)(duplication)，并能較準(zhǔn)確的測定其大小，并精確定位。不需要細(xì)胞培養(yǎng)，可直接檢測血液、羊水(amnioticfluid,AF)和絨毛膜絨毛(chorionicvillussampling,CVS)樣本，出報(bào)告速度更快，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。檢測≥10%水平的嵌合體鑒定雜合子缺失LOH和單親二倍體(uniparentaldisomy，UPD)，親緣關(guān)系的分析。分辨率高：30Kb結(jié)合全基因擴(kuò)增技術(shù)，可以進(jìn)行胚胎全染色體組的檢測------PGS/PGD第二十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日自身局限性：不能檢測染色體平衡易位(相互易位、羅伯遜易位、倒位、平衡插入）不能檢測點(diǎn)突變及串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)增導(dǎo)致的遺傳病(如脆性X染色體綜合征）不能檢測到低于本平臺(tái)檢測下限的基因組不平衡現(xiàn)象不能檢測三倍體以上的多倍體會(huì)檢測出臨床意義不明拷貝數(shù)變異(copynumbervariants,CNVs)。第二十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日CMA基因芯片染色體核型分析FISH檢測范圍整套染色體數(shù)目異常和微缺失、微重復(fù)結(jié)構(gòu)異常整套染色體數(shù)目異常，大片段缺失、重復(fù)，平衡及不平衡易位，倒位靶向檢測細(xì)胞培養(yǎng)不需要需要兩者均可單親二倍體YesNoNo近親結(jié)婚YesNoNo分辨率30Kb5-10Mb100Kb嵌合體YesYesYes染色體芯片與傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)比較第二十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體微缺失和微重復(fù)綜合征概念：染色體微陣列技術(shù)（chromosomalmicroarrayanalysis，CMA）和熒光原位雜交技術(shù)（florescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）的應(yīng)用，使許多用傳統(tǒng)染色體核型分析難以識(shí)別的染色體綜合征得以發(fā)現(xiàn)。這些綜合征缺失和重復(fù)的大小多在幾百Kb到幾兆堿基對(duì)。與單基因病不同，其癥狀受多基因影響，因而又稱連續(xù)性基因缺失或重復(fù)綜合征(contiguousgenedeletionorduplicationsyndrome）。大部分綜合征不能被染色體核型分析所識(shí)別，因而成為微缺失和微重復(fù)綜合征(microdeletionandmicroduplicationsyndrome）。

第二十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日拷貝數(shù)變異(copynumbervariants,CNVs)：

指大于1kb染色體變異(基因組變異)，包括核型分析檢測不到的基因組微缺失和微重復(fù)，被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于人類基因組中。已有大量研究證實(shí)CNVs與許多疾病相關(guān)，包括數(shù)百種染色體微缺失、微重復(fù)綜合征，是先天畸形和神經(jīng)發(fā)育障礙的主要遺傳病因，包括智力低下(mentalretardation,MR)，自閉癥(autism),精神分裂癥(Schizophrenia)等。第二十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日三、染色體微陣列技術(shù)

臨床應(yīng)用第三十頁，共七十二頁，2022年，8月28日出生缺陷干預(yù)----關(guān)注生殖全程染色體異常產(chǎn)前診斷孕前診斷精子產(chǎn)后先天性疾病診斷卵子+胚胎胎兒新生兒、兒童早期診斷早期干預(yù)改善預(yù)后夫妻雙方檢測正常再次生育再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低致病片段攜帶再次生育再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高第三十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體微陣列技術(shù)臨床應(yīng)用植入前遺傳病篩查和植入前遺傳病診斷(PGD/PGS)產(chǎn)前診斷產(chǎn)后遺傳病診斷反復(fù)習(xí)慣性自然流產(chǎn)病因分析第三十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日對(duì)植入前胚胎或卵裂球作染色體和/或基因?qū)W檢測，將無疾病胚胎植入子宮妊娠，并出生正常子代的技術(shù)輔助生殖與遺傳學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種產(chǎn)前診斷方法關(guān)鍵點(diǎn)是建立單細(xì)胞遺傳診斷技術(shù)孕前診斷-----植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)

(preimplantationGeneticDiagnosis,PGD)第三十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日高齡產(chǎn)婦反復(fù)體外受精失敗反復(fù)流產(chǎn)嚴(yán)重的男性不育癥父母為平衡易位、倒位攜帶者非整倍體是輔助生殖低妊娠率和高流產(chǎn)率的主要因素，PGS的目的是識(shí)別整倍體的正常胚胎轉(zhuǎn)移，以實(shí)現(xiàn)增加懷孕的機(jī)會(huì)CMA植入前胚胎遺傳學(xué)篩查/診斷適應(yīng)人群1in10couples第三十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日第三十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日CMA產(chǎn)前診斷適應(yīng)人群父母為平衡易位攜帶者胎兒B超檢查發(fā)現(xiàn)異常羊水染色體核型分析已發(fā)現(xiàn)異常，但無法確定異常染色體的確切位置或來源胎兒發(fā)現(xiàn)新發(fā)的染色體相互易位，需進(jìn)一步排除微缺失和微重復(fù)希望更全面、更準(zhǔn)確的了解胎兒染色體情況，以排除出生缺陷的可能性（生長發(fā)育遲緩，智力低下、自閉癥等原因）產(chǎn)前診斷第三十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日產(chǎn)前診斷第三十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日用于檢測CNV的染色體芯片（CMA)在下列情況應(yīng)作為一線檢測手段非已知綜合癥的多發(fā)畸形非綜合癥型的發(fā)育遲緩/智力低下孤獨(dú)癥譜系疾病進(jìn)一步明確發(fā)育遲緩、語言發(fā)育落后和其他尚不明確遺傳學(xué)病因的癥狀對(duì)于一些CMA檢出不平衡的病例，建議用細(xì)胞遺傳/FISH進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)對(duì)父母進(jìn)行臨床遺傳評(píng)估和咨詢產(chǎn)后出生缺陷患兒遺傳病診斷第三十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日TheAmericanJournalofHumanGenetics86,749–764,May14,2010發(fā)育障礙和智力低下等先天缺陷疾病首選CMA產(chǎn)后出生缺陷患兒遺傳病診斷21698例不明原因發(fā)育遲緩、低智，孤獨(dú)癥，多發(fā)畸形芯片（CMA)檢測：診斷率15%-20%核型分析：診斷率僅3%

第三十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日金域檢驗(yàn)（2013-2016）：4750例，26.3%截止2016年5月，金域檢驗(yàn)已采用CMA檢測出生缺陷/遺傳病病例4750例，其中陽性病例1249例，檢出陽性率達(dá)26.3%患者臨床表型智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形、自閉癥第四十頁，共七十二頁，2022年，8月28日第四十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日患者臨床表型解析臨床表型例數(shù)陽性率智力低下16916.0%發(fā)育遲緩29625.0%多發(fā)畸形11626.7%自閉癥1237.3%癲癇1277.9%兩個(gè)系統(tǒng)的異常52329.1%三個(gè)或以上系統(tǒng)的異常64633.9%智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等為CMA主要適應(yīng)癥；合并不同臨床表型病例，CMA診斷陽性率較高；第四十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日CMA檢出CNV類型分析CMA可檢出微缺失/微重復(fù)、單親二倍體、非整倍體、嵌合體等多種CNV類型CNV片段大于5MB（核型分析檢測下限）:理想情況下核型檢出率為4.95%，遠(yuǎn)低于CMA26.1%的檢出率。第四十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日檢出微缺失/微重復(fù)綜合征舉例第四十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日微缺失/微重復(fù)類型檢測出最常見染色體522例陽性樣本中所檢測出的UPD類型及疾病相關(guān)性第四十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日患者雙親評(píng)估十分必要為降低患者父母再生育風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于患者父母進(jìn)行相關(guān)檢測，可有效指導(dǎo)其再次生育。由于CMA不能檢測染色體平衡易位，故核型分析和FISH技術(shù)在某些特定情況下仍具有優(yōu)勢。部分染色體微缺失/微重復(fù)陽性樣本按其遺傳方式分類第四十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日小結(jié)CMA對(duì)于智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形等多種臨床異?？捎行г\斷，明顯優(yōu)于染色體核型分析，可取代其作為遺傳病診斷的一線檢測手段；對(duì)于患者雙親后續(xù)遺傳學(xué)檢測及分析，要選擇合適的方法學(xué)，做好遺傳咨詢工作，對(duì)再次生育做指導(dǎo)。第四十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日第四十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日染色體異常是導(dǎo)致流產(chǎn)的重要病因

約10%~15%妊娠會(huì)發(fā)生自然流產(chǎn)，其中絕大多數(shù)發(fā)生在孕早期，且50%左右是由于染色體異常所致。包括染色體數(shù)目異常占86%(包括非整倍體和多倍體)，結(jié)構(gòu)異常(染色體缺失和/或重復(fù))占6%，嵌合體占8%。（以往文獻(xiàn)報(bào)道）染色體芯片對(duì)流產(chǎn)物檢測第四十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日目前流產(chǎn)物檢測常用手段為核型分析與熒光原位雜交(fluorescentinsituhybridization,FISH)。核型分析：5Mb以上遺傳物質(zhì)改變，無法對(duì)許多具有致病性的染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的變異--染色體微缺失/微重復(fù)做出檢測。此外需對(duì)絨毛組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，耗時(shí)較長，且容易污染。一些活性差的細(xì)胞生長受到抑制，或者母體細(xì)胞過度生長，這都會(huì)導(dǎo)致得不到準(zhǔn)確核型。而臨床上部分流產(chǎn)物已不具有細(xì)胞活性，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。FISH檢測：可避免細(xì)胞培養(yǎng)，然而僅能對(duì)特異染色體數(shù)目異常進(jìn)行篩查，常用探針為13、16、18、21、22、X、Y探針，無法對(duì)與特異探針結(jié)合的其它染色體數(shù)目異常進(jìn)行檢測，因此存在假陰性的可能。CMA：可在全基因組范圍內(nèi)同時(shí)檢測染色體數(shù)目異常和染色體微缺失、微重復(fù)等結(jié)構(gòu)異常、嵌合體和ROHs等，無需細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期短，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠第五十頁，共七十二頁，2022年，8月28日第五十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日非整倍體中16三體所占比例最高(20.5%)，且均在孕早期流產(chǎn)。其次為Turner綜合征(14.5%)，流產(chǎn)可發(fā)生孕期各階段。絕大多數(shù)染色體非整倍體為新生突變，而D組(13,14,15)和G組(21,22)有發(fā)生羅伯遜易位的可能，建議夫妻雙方做核型分析，排除羅伯遜易位的可能性。孕婦年齡為發(fā)生染色體數(shù)目異常高危因素，而本文小于35歲發(fā)生染色體數(shù)目異常導(dǎo)致流產(chǎn)占24.6%由于染色體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致流產(chǎn)81.25%為反復(fù)習(xí)慣性流產(chǎn)，提示

夫妻雙方是平衡易位(75%)，建議再次生育做PGD。染色體內(nèi)部微缺失/微重復(fù)例如DiGeorge、Williams、Beckwith-Wiedemann等綜合征流產(chǎn)發(fā)生在孕晚期，核型分析

無法檢測。UPD第五十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日小結(jié)CMA能夠提供快速、準(zhǔn)確的流產(chǎn)物全基因組分析，能夠檢測染色體數(shù)目異常、結(jié)構(gòu)異常、嵌合體和ROHs等，且無需標(biāo)本培養(yǎng)，能提供比傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測更多的遺傳信息，可為流產(chǎn)病因分析和對(duì)夫妻雙方再次生育指導(dǎo)提供更有價(jià)值的信息。指導(dǎo)下一次妊娠減輕患者不必要的心理負(fù)擔(dān)。第五十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日檢測標(biāo)本活檢的單個(gè)卵裂球絨毛引產(chǎn)胎兒組織羊水臍血外周血第五十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日四.病例分享第五十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日第五十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日AssociationofCNVwithobesity第五十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日AssociationofCNVwithobesity第五十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日AssociationofCNVwithepilepsy第五十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日第六十頁，共七十二頁，2022年，8月28日癲癇神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病，例如ADHD,精神分裂癥肥胖、矮小先天性心臟病過度生長綜合征CMA出生缺陷檢測適應(yīng)癥智力低下生長、運(yùn)動(dòng)、語言發(fā)育遲緩多發(fā)畸形自閉癥譜系疾病主要適應(yīng)癥拓展適應(yīng)癥第六十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日出生缺陷患兒檢測流程第六十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日GenotypefirstvsPhenotypefirstWholegenomescreeningvsCandidateapproachGrafWD,LePichonJB,BittelDC,AbdelmoityAT,andYuS.Practiceparameter:evaluationofthechildwithmicrocephaly(anevidence-basedreview):reportofthequalitystandardssubcommitteeoftheAmericanAcademyofNeurologyandthePracticeCommitteeoftheChildNeurologySociety.Neurology.2010;74(13):1080-1.LedbetterDH.Cytogenetictechnology--genotypeandphenotype.NEnglJMed.2008;359(16):1728-30.BejjaniBAandShafferLG.Clinicalutilityofcontemporarymolecularcytogenetics.AnnuRevGenomicsHumGenet.2008;9:71-86.第六十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日63五.染色體微陣列技術(shù)局限性、結(jié)果判讀及帶來的挑戰(zhàn)第六十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日自身局限性：不能檢測染色體平衡易位(相互易位、羅伯遜易位、倒位、平衡插入）不能檢測點(diǎn)突變及串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)增導(dǎo)致的遺傳病(如脆性X染色體綜合征）不能檢測到低于本平臺(tái)檢測下限的基因組不平衡現(xiàn)象不能檢測三倍體以上的多倍體會(huì)檢測出臨床意義不明CNV。第六十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日由于CMA不能檢測染色體平衡易位，故染色體核型分析和FISH技術(shù)在某些特定情況下