蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)

常用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)介紹SPR技術(shù)分析蛋白質(zhì)相互作用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯鑒定蛋白質(zhì)相互作用

coupledtranscription/translationreaction

偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程

continuousexchangecell-free(CECF)principle

持續(xù)交換和非細(xì)胞體系的原理

偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程T7-RNApolymeraseE.colilysategeneDNAcoupledtranscription/translationproteingene持續(xù)交換和非細(xì)胞體系的原理T7RNApolymeraseTranslationmachineryE.coliEnergyregeneratingsystemProteinDNAtemplateAminoacidsEnergysubstratesBuffercomponentsNTPsSupplyAminoacidsEnergysubstratesBuffercomponentsNTPsSupplyInhibitoryby-productsInhibitoryby-productsmembranemembrane供給腔反應(yīng)腔供給腔microtiter-platePCRtubesRTS500devicesmicrocentrifugetubes4x12RTS1008x96xRTS100RTS500反應(yīng)裝置reactionchamberfeedingchamberwithsemipermeablemembranesRTS500ProteoMasterE.coliHYKit

質(zhì)譜

X射線(xiàn)結(jié)晶學(xué)核磁共振

結(jié)構(gòu)生物學(xué)的蛋白標(biāo)記theaminoacidsandmethioninearebothprovidedseparatelyfromallotherkitreagentsotherdesiredamino

acidscanbeexchangedbyusingtheRTSAminoAcidSamplerincombinationwiththeRTS500HY

RTS500HYMethioninespecificlabelingofproteinsispossiblebysubstitutingthemethionineor結(jié)構(gòu)分析GST融合蛋白鑒定蛋白質(zhì)相互作用GSTPULL-DOWN：通過(guò)與GST融合蛋白質(zhì)探針蛋白質(zhì)相互作用從可溶性蛋白質(zhì)庫(kù)中親和純化一個(gè)未知蛋白質(zhì)，再通過(guò)GST與谷光苷肽偶聯(lián)球珠的結(jié)合收集相互作用蛋白質(zhì)，從而分離出蛋白質(zhì)復(fù)合物。

1含有表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)；2誘導(dǎo)表達(dá)；3收集菌體；4加蛋白酶抑制劑，冰上破碎細(xì)胞；5離心取上清，按1：1的比例加谷光苷肽瓊脂糖球珠，在4C，溫和混勻30分鐘；6離心收集瓊脂糖球珠，用PBS輕輕混勻懸浮，反復(fù)三次；7將混合物裝柱，讓PBS流出；8加還原性的GSH將融合蛋白洗脫；9SDS檢測(cè)蛋白質(zhì)純化情況。注意：絕大部分工作應(yīng)在4C進(jìn)行；對(duì)照？GST融合蛋白純化基本程序免疫共沉淀鑒定蛋白質(zhì)相互作用當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)之間的結(jié)合保持下來(lái)，因而可以據(jù)此檢測(cè)生理?xiàng)l件下相關(guān)蛋白質(zhì)間的相互作用。如果蛋白質(zhì)X用其抗體免疫沉淀，在細(xì)胞內(nèi)與X穩(wěn)定結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也可能沉淀下來(lái)。蛋白質(zhì)Y的沉淀是基于與X的物理相互作用，被稱(chēng)為免疫共沉淀。注意：絕大部分工作應(yīng)在4C進(jìn)行；對(duì)照？串聯(lián)親和純化鑒定蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)復(fù)合體TandemaffinitypurificationTAP將靶蛋白與蛋白質(zhì)標(biāo)簽融合并在天然宿主細(xì)胞中表達(dá)，制備提取物，然后采用標(biāo)準(zhǔn)的兩步法重獲靶蛋白及