水稻品種指紋檢測及其應用

水稻品種指紋檢測及其應用第一頁，共十六頁，2022年，8月28日實驗目的學習SSR指紋圖譜的構建原理與方法應用SSR指紋圖譜進行水稻品種的鑒別第二頁，共十六頁，2022年，8月28日實驗原理1、生物具有豐富的遺傳多樣性，并在個體形態(tài)上表現(xiàn)出千姿百態(tài)。2、DNA分子標記技術的發(fā)展，使得在DNA分子水平揭示生物的遺傳多樣性成為可能。（穩(wěn)定性好、不受環(huán)境和發(fā)育時期限制等多方面優(yōu)越性）3、DNA指紋圖譜（條碼技術）能有效鑒別不同生物物種或同一物種的不同基因型。4、常用的幾種DNA分子標記：1）RFLP2）SSR3）RAPD4）AFLP5）SCAR：sequencecharacterizedamplifiedregion6）CAPS：cleavedamplifiedpolymorphicsequence7）InDel第三頁，共十六頁，2022年，8月28日SSR分子標記的原理：

SSR序列特征：如：————(AG)n————(AG)n,n=36(AG)n,n=112(AG)n,n=75第四頁，共十六頁，2022年，8月28日SSR的PCR擴增及電泳檢測

一般為共顯性，在F2群體中，理論上[A]：[AB]：[B]=1：2：1

ABABBABA…………

第五頁，共十六頁，2022年，8月28日標記等位基因的識別與標識RM267多態(tài)性RM522單態(tài)性標記RM552多態(tài)性ABCABDC第六頁，共十六頁，2022年，8月28日表1不同基因型SSR指紋圖譜示例標記基因型M1M2M3M4M5M6M7M8M9…P1ABBABCABFP2CBAADDBACP3BBADCFEBAP4EBADCBBAB影響指紋圖譜特異性的主要因素：1、生物內(nèi)在的遺傳多樣性2、標記的多態(tài)性3、標記的數(shù)目第七頁，共十六頁，2022年，8月28日應用SSR指紋圖譜鑒定雜交稻真假雜種的實例Ref：彭鎖堂、莊杰云、顏啟傳、鄭康樂.我國主要雜交水稻組合及其親本SSR標記和純度鑒定.中國水稻科學,2003,17(1):1～5SSR標記RM17對雜交稻“兩優(yōu)培九”100粒單種子的擴增結果(M分子量Marker，A不育系，R恢復系，2輪點樣）第八頁，共十六頁，2022年，8月28日實驗材料1、2個雜交稻品種及其4個親本品種1）紅蓮優(yōu)6號（粵泰/揚稻6號）2）兩優(yōu)培九（培矮64S）3）P14）P25）P36）P42、6個SSR標記（見右表）3、分組：1）4人一組，用2個標記分別對6個水稻品種進行PCR擴增2）每3個小組的實驗結果整合到一起，用于實驗報告的撰寫Chr.Markers引物編號Chr.6RM587引物1Chr.8RM264引物2Chr.9RM278引物3Chr.10RM228引物4Chr.11RM202引物5Chr.12RM17引物6第九頁，共十六頁，2022年，8月28日實驗方法

反應因子單個反應體積（ul）9個反應用量（ul）1、ddH2O10.090.02、10×buff2.018.03、25mMMgCl21.816.24、10mMdNTPs1.09.05、5uMprimer2.018.06、5U/ulTaq酶0.21.8(取用前先離心)7、DNA模板3.0

1、PCR反應體系配制：在0.5ml離心管中配制反應混合液第十頁，共十六頁，2022年，8月28日1)先按9個反應所需量配制因子1-6的混合液，瞬時離心混勻2)將混合液分裝到6個反應管中，每管17ul3)向每管分別添加6個水稻品種的DNA模板，4)再向每管各加1小滴礦物油，瞬時離心5)按標記（每標記1列）將反應管安放到PCR儀上每個標記分別在1個0.5ml離心管中配制反應混合液第十一頁，共十六頁，2022年，8月28日

①94℃預變性5min ②94℃變性1min ③55℃退火1min ④72℃延伸1min ⑤重復步驟②-④35次 ⑥72℃延伸10min注：退火溫度對擴增產(chǎn)物的影響？2、PCR擴增程序第十二頁，共十六頁，2022年，8月28日1）制膠：用1×TAE液配制4%瓊脂糖凝膠70ml,加染色劑2）點樣：每管加入2ul溴酚蘭加樣緩沖液，瞬時離心。取15ul擴增產(chǎn)物點樣

(請注意點樣順序)3）電泳：穩(wěn)壓（100V），電泳1-1.5h4）觀察：紫外燈下觀察電泳結果3、瓊脂糖凝膠電泳第十三頁，共十六頁，2022年，8月28日多態(tài)性標記的篩選4