基因表達(dá)的檢測

關(guān)于基因表達(dá)的檢測第1頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三一、基因表達(dá)的概述：從基因到蛋白質(zhì)――中心法則：

DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制2.教學(xué)目的：了解檢測基因表達(dá)主要方法的原理及大概操作要點(diǎn)理解各檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)懂得合理選擇實(shí)驗(yàn)方法及對各實(shí)驗(yàn)結(jié)果的合理解釋第2頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三二、基因表達(dá)調(diào)控的基本概念與原理：基因表達(dá)調(diào)控的概念及方式：基因：一個(gè)遺傳單位，是一段可表達(dá)的DNA序列?；蚪M：一個(gè)單倍體細(xì)胞或病毒顆粒的全套基因。人類基因組含約4萬個(gè)基因。基因表達(dá)：基因所包含的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄生成RNA，再經(jīng)過翻譯生成蛋白質(zhì)的過程。一般而言，在某一特定時(shí)刻，高等生物僅有不到15%的基因表達(dá)。基因表達(dá)調(diào)控：基因表達(dá)有其特定的規(guī)律，并受到機(jī)體各種因素的調(diào)節(jié)和控制。對基因的表達(dá)實(shí)施精確的控制，使細(xì)胞適應(yīng)不同階段、不同環(huán)境條件下的生長與發(fā)育的需要，維持機(jī)體正常生命活動(dòng)，有著重要意義?？烧T導(dǎo)基因：基因表達(dá)的時(shí)間特異性基因表達(dá)的空間特異性（組織特異性）看家基因:第3頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三2.基因表達(dá)調(diào)控的基本原理：原核生物和真核生物的基因表達(dá)調(diào)控盡管在細(xì)節(jié)上差異很大，但兩者的調(diào)控模式和原理極為相似。調(diào)節(jié)作用主要包括核酸之間的相互作用、核酸與蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。調(diào)控作用可能是正向的或負(fù)向的。調(diào)控點(diǎn)可以位于基因表達(dá)過程的各個(gè)環(huán)節(jié)，如基因的激活、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工、mRNA降解、蛋白質(zhì)翻譯、翻譯后加工和蛋白質(zhì)降解等。特異DNA序列對基因表達(dá)的影響：真（原）核生物DNA分子上的特定序列構(gòu)成了基因表達(dá)的基本信號：起始密碼、調(diào)控序列、編碼序列、終止密碼、單拷貝序列、重復(fù)序列等。第4頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用對基因表達(dá)的影響：DNA上的特定序列可以與相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，這些蛋白質(zhì)依其作用分為：阻遏蛋白（repressor）：與操縱序列結(jié)合，阻遏基因的轉(zhuǎn)錄。激活蛋白（activator）：與啟動(dòng)子中的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。特異因子轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF）也稱反式作用因子（trans-actingfactor）：通過與順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性DNA-蛋白質(zhì)之間的結(jié)合通常是非共價(jià)鍵的形式，通過蛋白質(zhì)分子中特殊的結(jié)構(gòu)域與DNA分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。常見的DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合域有：螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋（helix-turn-helix）鋅指（zincfingers）第5頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)之間相互作用對基因表達(dá)的影響：調(diào)節(jié)蛋白通常通過二聚體（dimer）或多聚體（polymer）的形式與DNA結(jié)合不同的調(diào)節(jié)蛋白也可以相互作用或結(jié)合后，再與DNA特定部位結(jié)合，調(diào)節(jié)同一基因的不同轉(zhuǎn)錄水平，尤其多見于真核生物。蛋白質(zhì)之間相互作用的典型特征包括：亮氨酸拉鏈（leucinezipper）螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋（helix-loop-helix）RNA聚合酶對基因表達(dá)的影響：轉(zhuǎn)錄起始是通過RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的，轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中最重要、最基礎(chǔ)的調(diào)控點(diǎn)之一。不同啟動(dòng)子的序列不同，因而影響它們與RNA聚合酶結(jié)合的親和力，親和力的不同繼而直接影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率。RNA聚合酶和啟動(dòng)子的結(jié)合也會(huì)受到調(diào)節(jié)蛋白的影響,阻遏蛋白、激活蛋白、特異因子、轉(zhuǎn)錄因子等均可通過增強(qiáng)或者干擾RNA聚合酶與啟動(dòng)子之間的結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的起始。第6頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三三、原核生物的基因表達(dá)調(diào)控：

原核生物結(jié)構(gòu)簡單、無細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄和翻譯過程耦聯(lián)在一起，對環(huán)境條件的變化反應(yīng)迅速，可以根據(jù)環(huán)境因素的變化迅速調(diào)整自身基因的表達(dá)，滿足其生長和繁殖的需要。原核基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)為：普遍存在操縱子調(diào)控模式通過特異的阻遏蛋白或激活蛋白調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄與翻譯的耦聯(lián)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：乳糖操縱子的調(diào)控：第7頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三阻遏蛋白對乳糖操縱子的調(diào)節(jié)第8頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三2）其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制：轉(zhuǎn)錄衰減：基因重組：翻譯水平的調(diào)控：SD序列對翻譯的影響：SD序列是原核生物mRNA起始密碼子AUG上游3-10堿基的由3-9個(gè)堿基組成的一個(gè)富含嘌呤核苷酸的序列，能與核糖體小亞基16srRNA3’末端富含嘧啶的序列互補(bǔ)，從而使核糖體與mRNA結(jié)合，開始翻譯。mRNA的穩(wěn)定性：原核細(xì)胞內(nèi)mRNA通常很快被降解。例如：E.coli的許多mRNA在37℃時(shí)的平均壽命只有大約2分鐘。翻譯產(chǎn)物對翻譯的影響：有些mRNA編碼的蛋白質(zhì)，本身就是在蛋白翻譯過程中發(fā)揮作用的因子。這些因子可對自身的翻譯產(chǎn)生調(diào)控作用。如起始因子3（IF-3），當(dāng)它合成過多時(shí)，能有效地校正和抑制其自身的起始密碼子與起始tRNA的配對而抑制翻譯的起始。另外還有核糖體蛋白、翻譯終止因子等均可影響翻譯過程。第9頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三四、真核生物的基因表達(dá)調(diào)控：真核生物基因表達(dá)調(diào)控與原核不同點(diǎn)在于：轉(zhuǎn)錄激活與染色體轉(zhuǎn)錄區(qū)特定結(jié)構(gòu)相適應(yīng)正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄與翻譯在空間上的分離更多、更復(fù)雜的調(diào)控蛋白第10頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（一）、DNA水平的調(diào)控（真核生物表達(dá)調(diào)控的次要和輔助手段）：染色質(zhì)（chromatin）結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)的調(diào)控作用： 真核基因通常與組蛋白（histone）結(jié)合形成核小體，從而保護(hù)DNA免受損傷，維持基因組穩(wěn)定，抑制基因的表達(dá)。影響基因表達(dá)水平的主要有：組蛋白的含量組蛋白的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白與組蛋白H1和H5竟?fàn)幒虳NA的結(jié)合，從而解除組蛋白對基因表達(dá)的抑制作用?；蛐揎棇虮磉_(dá)的調(diào)控作用： 胞嘧啶經(jīng)甲基化為5-甲基胞嘧啶（常出現(xiàn)在5’端側(cè)翼序列的GC豐富區(qū)），影響DNA特異序列與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使基因不能轉(zhuǎn)錄或阻止轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成。第11頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三基因丟失：在細(xì)胞分化過程中，可以通過丟失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。染色體破碎所致的不均等分配。僅發(fā)生在低等生物中（原生動(dòng)物、線蟲、昆蟲、甲殼類動(dòng)物等），此現(xiàn)象在高等生物中迄今尚未發(fā)現(xiàn)。基因擴(kuò)增：細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性地大量增加的現(xiàn)象，它是細(xì)胞在短期內(nèi)為滿足某種需要（發(fā)育需要、外界環(huán)境因素）而產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物的一種調(diào)控手段。第12頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三基因重排：

基因重排是指某些基因片段改變原來的存在順序，通過調(diào)整有關(guān)基因片段的銜接順序，重新組成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。一種熟知的以基因重排來調(diào)節(jié)不同基因表達(dá)的例子是哺乳動(dòng)物免疫球蛋白各編碼區(qū)的連接：一個(gè)免疫球蛋白分子包括兩條相同的輕鏈和重鏈。輕鏈：可變區(qū)、恒定區(qū)、連接區(qū)都由位于同一染色體不同位置的DNA片段編碼，在形成活性基因前，上述各一個(gè)基因通過染色體內(nèi)重組成連到一起。重鏈：可變區(qū)、恒定區(qū)、連接區(qū)、歧化區(qū)第13頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（二）、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控中最重要的環(huán)節(jié)，大多數(shù)生物基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是決定細(xì)胞質(zhì)中mRNA水平的一個(gè)最重要方式，調(diào)控主要通過反式作用因子和RNA聚合酶的相互作用來實(shí)現(xiàn)。反式作用因子是一類細(xì)胞核內(nèi)存在的蛋白質(zhì)，是與特異的DNA序列（順式作用元件）結(jié)合的調(diào)控蛋白。它通過識別并結(jié)合上游啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子中的順式元件，激活或阻遏基因的表達(dá)。它包括三個(gè)功能域：DNA識別結(jié)合域（常有鋅指結(jié)構(gòu)）轉(zhuǎn)錄活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨）蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域（常具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)等）。第14頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過程有三步：TATA因子結(jié)合TATA盒（形成TATA因子－DNA復(fù)合物）RNApol識別并結(jié)合TATA因子－DNA復(fù)合物（閉合復(fù)合物，DNA雙鏈沒有打開，不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄）轉(zhuǎn)錄起始因子與RNApol結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（開放復(fù)合物，DNA雙螺旋已打開，可以合成RNA）轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控：

基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控主要通過反式作用因子、順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來完成。調(diào)控機(jī)制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用等。反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達(dá)調(diào)節(jié)：迅速合成、迅速降解共價(jià)修飾：磷酸化－去磷酸化、糖基化配體結(jié)合：激素－激素受體（是核內(nèi)的反式作用因子）蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用：max蛋白－c-myc蛋白（核內(nèi)的反式作用因子）第15頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三反式作用因子與順式元件結(jié)合的調(diào)節(jié)：順式作用元件包括：上游啟動(dòng)子元件遠(yuǎn)距離的增強(qiáng)子元件（上游增強(qiáng)子元件、下游增強(qiáng)子元件）反式作用因子作用方式的調(diào)節(jié)： 反式作用因子通過下列不同的方式作用到RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)從而影響其轉(zhuǎn)錄活性：成環(huán)扭曲滑動(dòng)連鎖反應(yīng)反式作用因子的組合式調(diào)節(jié)： 幾種不同的反式作用因子組合，發(fā)揮特定的作用。第16頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（三）、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控：

轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控一般是指基因轉(zhuǎn)錄后對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行一系列修飾、加工過程，主要包括mRNA選擇性剪切、胞內(nèi)定位以及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)：

DNA（核內(nèi)）

轉(zhuǎn)錄

mRNA前體

加工成熟mRNA

運(yùn)輸細(xì)胞質(zhì)

第17頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三mRNA前體加帽、加尾以調(diào)控其穩(wěn)定性：5’加帽（capping）：7－甲基鳥苷三磷酸3’端加尾（tailing）：多聚A（PolyA）mRNA前體的選擇性剪接（splicing）與拼接：選擇性剪切：去除mRNA前體中的內(nèi)含子選擇性拼接：從同一基因產(chǎn)生若干種有部分相同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，即通過Mrnau前性的選擇性拼接而產(chǎn)生不同的成熟mRNA，然后翻譯成不同的蛋白質(zhì)。選擇性表達(dá)：多基因的基因家族中的各成員在特定的細(xì)胞中，在一定的發(fā)育階段和在一定的生理?xiàng)l件下選擇性的表達(dá)。第18頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三RNA編輯的調(diào)控：

RNA編輯（editing）：是指轉(zhuǎn)錄后的mRNA前體在編碼區(qū)發(fā)生核苷酸改變的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生出氨基酸序列不同的蛋白質(zhì)。包括：核苷酸的替換核苷酸的插入或缺失mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控：mRNA前體經(jīng)過加帽、加尾、剪切等加工后通過核膜孔從核內(nèi)運(yùn)至胞漿。大約只有20%的mRNA進(jìn)入胞漿，留在核內(nèi)的mRNA約50%會(huì)在1小時(shí)內(nèi)降解。第19頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（四）、翻譯水平的調(diào)控：

翻譯水平的調(diào)控主要是控制mRNA的穩(wěn)定性和mRNA翻譯的起始頻率，是一種迅速控制基因表達(dá)的方式，是各種高等生物廣泛采用的調(diào)控方式。mRNA的穩(wěn)定性，取決于：mRNA的二級結(jié)構(gòu)（不易受外切酶攻擊）帽子及其種類polyA尾的長短與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的種類mRNA翻譯起始的調(diào)控（即控制mRNA的可翻譯性）：許多蛋白質(zhì)因子可以影響蛋白質(zhì)合成的起始，如真核生物起始因子－2（eukaryoticinitiationfactor，eIF-2）的磷酸化會(huì)使其活性降低，從而減少蛋白質(zhì)合成。Recruitmentfactor可使maskedmRNA與核糖體、氨?；?tRNA、蛋白質(zhì)結(jié)合。真核生物蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控： 某些蛋白可抑制其自身mRNA的翻譯第20頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三（五）、翻譯后水平的調(diào)控： mRNA翻譯的產(chǎn)物－－新生多肽鏈大多是沒有生物學(xué)活性的，必須經(jīng)過加工、修飾才能成為有活性的蛋白質(zhì)，加工、修飾過程包括：信號肽的切除：由15－30個(gè)疏水氨基酸組成的信號肽可使蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入高爾基體。新生肽鏈的修飾：磷酸化、羥基化、糖基化、乙?；?。肽鏈的剪切與正確折疊第21頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三五、蛋白表達(dá)水平的檢測方法及選擇DNA水平的檢測：SouthernblotPCRDNA測序蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測：SDS－PAGE與WesternblotELISA流式細(xì)胞儀（FACS）檢測免疫組化蛋白質(zhì)芯片mRNA水平的檢測：Northernblot基因芯片Nucleirun-on原位雜交RT-PCR實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR半定量RT－PCR第22頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三SouthernBlot原理：DNA－DNA雜交操作過程：基因組DNA經(jīng)過一種或多種限制性內(nèi)切酶消化消化后的DNA片段在標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠上經(jīng)電泳按照大小進(jìn)行分離DNA經(jīng)原位變性后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固定支持物上（通常為尼龍膜或硝酸纖維素膜）變性的DNA可以與標(biāo)記的DNA、RNA或寡核苷酸探針雜交通過特定的檢測方法（如放射自顯影）來確定與探針互補(bǔ)的帶的位置；或通過對經(jīng)過不同限制性內(nèi)切酶（單一或聯(lián)合使用的）消化過的基因組DNA產(chǎn)生的帶的大小及數(shù)量的估計(jì)來判斷結(jié)果第23頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三

重物（400克）瓊脂糖凝膠濾紙濾紙橋尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板支持物20XSSC上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖第24頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三PolymerasedChainReaction(PCR)原理：高溫下雙鏈DNA變性為單鏈DNA低溫下單鏈DNA與引物寡核苷酸復(fù)性中溫下由DNA聚合酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的修復(fù)復(fù)制過程第25頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三2.方法10X反應(yīng)緩沖液：PH8.8-8.3Mg2+0.5-5.0mmol/L，K+50-100mmol/L，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）模板DNA引物（引物是PCR反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵之一）上游引物下游引物TaqDNA聚合酶ddH2O95C1min55C1min72C1min4C35X第26頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三DNA序列測定Sanger雙脫氧未端終止法測序原理：

聚合酶擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增的同時(shí)在部分產(chǎn)物末端摻入四色熒光標(biāo)記的四種ddNTPs電泳分離、激光讀序

ABI377全自動(dòng)測序儀進(jìn)行DNA核苷酸序列測定方法：

引物準(zhǔn)備：純度：須事先用PAGE膠純化過濃度：配制成5-10pmol/uL

第27頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三模板準(zhǔn)備：純度：推薦使用試劑盒進(jìn)行純化模板量：PCR產(chǎn)物100-200bp2-4ng單鏈50-100ng

200-500bp4-10ng雙鏈200-500ng

500-1000bp6-20ng粘粒、BAC0.5-1ug

1000-2000bp10-40ng細(xì)菌基因組DNA2-3ug

2000bp80-2000ng測序PCR：用于PCR產(chǎn)物，單、雙鏈加樣：TerminatorReadyReactionMix8.0ul模板不定量引物3.2pmolddH2O不定量合計(jì)20ul反應(yīng)：96C10sec50C5sec60C4min4C70X第28頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三純化測序產(chǎn)物：加50ul95%乙醇，混勻置室溫（25度）15分鐘，12000g離心20分鐘，棄上清加150ul75%乙醇洗1-2次，同上離心10分鐘。棄上清，抽干。制備測序電泳用PAG變性膠

預(yù)電泳（Pre-run）

電泳數(shù)據(jù)分析

第29頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三SDS－PAGE與Westernblot

(蛋白凝膠電泳及免疫印跡法)原理：確保蛋白質(zhì)解離為單個(gè)多肽亞基（SDS）通過分離膠的篩分作用，將蛋白質(zhì)多肽按分子量的大小不同得到分離將蛋白質(zhì)固定于尼龍膜上以抗體識別待檢蛋白（抗原）固定物1Ab2AbE

蛋白質(zhì)（抗原）第30頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三2.操作過程樣品制備：收集細(xì)胞PBS洗滌并離心沉淀細(xì)胞加入適量細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，置冰上30分鐘高速離心，取上清（蛋白溶液）加入等量2XSDS－PAGE樣品緩沖液煮沸5分鐘后上樣（或保存于－20℃）制膠（不連續(xù)緩沖膠系統(tǒng)）：膠的成份：壓縮膠分離膠第31頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三膠濃度的選擇：丙烯酰氨濃度蛋白線性分離范圍/KDa1512107.5510－4312－6020－8036－9457－212加樣與電泳：加適量的樣品（200－1000ug總蛋白量）、對照及蛋白分子量marker180－200volts電泳直到溴酚藍(lán)跑出凝膠（Bio-Rad電泳裝置）第32頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三凝膠染色：考馬斯亮藍(lán)（R－250）染色銀染印跡轉(zhuǎn)移：原理：帶正電荷的蛋白質(zhì)在電場作用下從負(fù)極（凝膠）向正極（尼龍膜或硝纖膜）遷移，蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合到膜上4℃條件下，300mA電泳1－3小時(shí)（Bio-Rad電泳裝置）封閉：5%脫脂牛奶或5%BSA，室溫下1小時(shí)（或4℃過夜）一抗反應(yīng)：選擇合適的第一抗體適量抗體以5%脫脂牛奶或5%BSA稀釋室溫下1小時(shí)（或4℃過夜）反應(yīng)第33頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三二抗反應(yīng)：選擇合適的酶標(biāo)第二抗（第一抗體）體適量抗體以5%脫脂牛奶或5%BSA稀釋室溫下1小時(shí)（或4℃過夜）反應(yīng)加生色底物顯色HRP的底物：生色：4－氯－1－萘酚/H2O2發(fā)光：ECL溶液（魯米諾/4－碘代酚/H2O2）AP的底物：生色：氮藍(lán)四唑/5－溴－4氯吲哚磷酸發(fā)光：AMPPD拍片或曝光、洗片第34頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hrp53p21-TubulinTimeafterirradiationDNAdamageinducesdown-regulationofhistonegenetranscriptionwhichparallelscellcyclearrest第35頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不須純化而直接反映其中單個(gè)蛋白表達(dá)水平的變化用于觀察細(xì)胞處理后最后一步變化，結(jié)果最可靠、真實(shí)實(shí)驗(yàn)簡單可靠、重復(fù)性好缺點(diǎn)：不能反映蛋白質(zhì)變化的中間過程靈敏度相對較低，多用于檢測細(xì)胞表達(dá)量較大的蛋白質(zhì)的變化對抗體的依賴度高應(yīng)用：直接檢測蛋白質(zhì)的有無、變化可直接檢測部分蛋白的功能與其它方法結(jié)合后，可檢測蛋白－蛋白相互作用第36頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）原理：將可溶性蛋白質(zhì)（單一組分或混合組分）固定于酶標(biāo)板壁上－－抗原或抗體檢測待檢蛋白－－抗體或抗原固定物1Ab2AbE

蛋白質(zhì)（抗原）第37頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三2.操作過程（間接法、雙抗體夾心法）樣品處理：已知樣品必須是可溶性蛋白－－溶于PBS、水等樣品可以是單一組分或混合組分包板：適量的抗原以高PH溶液（PH7.6－7.8的碳酸鹽緩沖液）或低PH溶液（PH4.8枸椽酸鹽緩沖液）稀釋后包被酶標(biāo)板4℃反應(yīng)1－2天PBS洗滌后，即可使用該板或可較長期保存封閉：4%脫脂牛奶或4%BSA，室溫下1小時(shí)（或4℃過夜）第38頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三一抗反應(yīng)：選擇合適的第一抗體適量抗體以4%脫脂牛奶或4%BSA稀釋室溫下1小時(shí)（或4℃過夜）反應(yīng)二抗反應(yīng)：選擇合適的酶標(biāo)第二抗（第一抗體）體適量抗體以4%脫脂牛奶或4%BSA稀釋室溫下1小時(shí)（或4℃過夜）反應(yīng)加生色底物顯色：HRP的底物：H2O2/TMB終止：2MH2SO4結(jié)果判斷：目測法儀器法第39頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：用于觀察細(xì)胞處理后最后一步變化，結(jié)果可靠、真實(shí)方法簡單（多樣）、快速可大批量檢測標(biāo)本敏感性較高缺點(diǎn)：不能反映蛋白質(zhì)變化的中間過程多用于檢測細(xì)胞表達(dá)量較大的可溶性蛋白質(zhì)的變化特異性相對較低，重復(fù)性相對較差對所用抗體的依賴度高應(yīng)用：大批量、直接檢測可溶性蛋白質(zhì)的有無、變化第40頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三WhatisFlowCytometry?FlowCytometryisapowerfultechniqueforcellcounting,sortingandsurfacemarkeranalyzingFlowCytometrycanprovidequantitativeinformationaboutcellsurfacemarkersBasedonimmunofluorescencetechniqueandcomputer-aidedanalysis流式細(xì)胞儀（FACS）檢測第41頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三原理：基于單個(gè)細(xì)胞水平的檢測第42頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三Fluorescence-activatedcellsorter(FACS)FACSisoneversionofFlowCytometry,whichcansortcellsbytheirsurfacemarkersIndividualcellispositivelyornegativelychargedbasedontheirfluorescencecolorWhenchargedcellspassthroughanelectricfield,theyaredeflectedandhenceseparated第43頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三2.FASC的應(yīng)用：細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞組分：DNA含量RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡細(xì)胞分化其它：白血病免疫分型造血干細(xì)胞血小板機(jī)體免疫功能各種基因癌基因和抑癌基因調(diào)節(jié)基因腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因多藥耐藥基因第44頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三UseFlowCytometrytoexamineCD4andCD8expressionduring

TcellmaturationTreatTcellpopulationwithanti-CD4monoclonalantibody(coupledwithdye1)andanti-CD8monoclonalantibody(coupledwithdye2)atdifferentmaturationstages,thensubjectthecellpopulationtoFACS.FlowCytometrydotplotswillbegenerated.第45頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三0.111010010000.11101001000dye1intensity(forCD4)dye2intensity(forCD8)DoubleNegative(CD4-,CD8-)Doublepositive(CD4+,CD8+)Singlepositive(CD4-,CD8+)Singlepositive(CD4+,CD8-)dieTcell(CD4-,CD8-)die第46頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

PurdueUniversityCytometryLaboratories第47頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三4hr,control28hr,irradiatedG1:94.1%S:1.5%G2/M:4.4%G1:94.1%S:1.1%G2/M:4.8%G1:60.6%S:34.9%G2/M:4.5%G1:96.6%S:1.6%G2/M:1.8%10%1%90%4%28hr,control28hr,aphidicolin第48頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三免疫組織化學(xué)法原理：組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等組分被原位固定以特異性抗體識別待檢蛋白并顯色方法：組織細(xì)胞固定：4%多聚甲醛，RT10min通透性處理：0.5%Triton-X100，RT10min封閉：5%馬血清、5%羊血清等，37°C15min一抗：關(guān)鍵二抗：熒光標(biāo)記封片，觀察第49頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三NPATconcentratesatafewfociinthenucleiofhumancells第50頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三G0G1SG2PrometaphaseAnaphaseCellcycle-dependentchangeofNPATlociinWI38cells第51頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三Figure7:IR-induceddispersionofNPATproteinfromhistonegenelocidependsonp53andp21.第52頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三Figure8:InhibitionofCdk2activitypreventsNPATfociformation.第53頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：不僅可以定性，更重要的是可以定位缺點(diǎn)：無法檢測表達(dá)量低的蛋白質(zhì)難以定量高度依賴于抗體操作過程比較復(fù)雜應(yīng)用：蛋白定位在哪里？去哪里？其它第54頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三NorthernBlot原理：將RNA固定于尼龍膜上以DNA探針識別待檢mRNA尼龍膜AEDCBRNABBB同位素標(biāo)記的DNA探針第55頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三2.操作過程總RNA提取：用RneasyMiniKit抽取總RNA（QIAGEN公司）用700ulSW1洗一次用500ulRPE洗2次用50ulRNasefreeddH2O洗脫兩次取2ul加入98ulddH2O，測取OD260/280并計(jì)算RNA濃度及總RNA得量制膠（變性1－1.5%Agarose膠）：制備100ml含有2.2mol/L甲醛的1.5%的瓊脂糖凝膠，加1.5克瓊脂糖凝膠粉到72ml滅菌水中，煮沸溶解后置55℃水浴，均衡后10mlMOPS電泳緩沖液和18ml去離子甲醛，在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)灌膠加入足夠量的1XMOPS電泳緩沖液，預(yù)電泳約5分鐘。備用。第56頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三RNA樣品預(yù)處理：在一滅菌EP管中建立變性反應(yīng)：RNA（多達(dá)20ug） 2.0ul10XMOPS電流緩沖液 2.0ul甲醛 4.0ul甲酰氨 10.0ul溴化乙淀 1.0ul65℃20分鐘變性，立即置冰上10分鐘簡短離心后備用電泳：上樣：等量總RNA/樣品4－5volts/cm電泳5－7小時(shí)。不能用過高的電壓！轉(zhuǎn)移：經(jīng)典方法：搭建“金字塔”，轉(zhuǎn)移過夜。第57頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三

重物（400克）瓊脂糖凝膠濾紙濾紙橋尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板支持物20XSSC上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖第58頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三DNA探針的制備：在一滅菌EP管中建立反應(yīng)：2.0ul 模板－GAPDHPCR產(chǎn)物（150bp,100ng/ul）6.0ul 10XEcoPolbuffer6.0ul dNTPs（無dCTP）3.0ul 5’-GAPDH(100ng/ul)3.0ul 3’-GAPDH(100ng/ul)31.0ul ddH2O煮沸10分鐘，立即置冰上10分鐘：加入： 2.5ul Klenow 6.5ul 32P-dCTP室溫下孵育6小時(shí)過柱純化已標(biāo)記探針（Phamarcia試劑盒）第59頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三取相等CPM量RNA，加入2mlTES/0.6MNaCL10mMTES10mMEDTA0.2%SDS在雜交爐中，68℃反應(yīng)過夜用2XSSC/0.1%SDS洗膜三次用0.1XSSC/0.1%SDS洗膜三次曝光于X光膠片Crosslink預(yù)雜交加入10ml雜交混合液，68℃反應(yīng)45分鐘雜交第60頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三H2AH3H4GAPDH0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hrTimeafterirradiationC.H2BH1DNAdamageinducesdown-regulationofhistonegenetranscriptionwhichparallelscellcyclearrestHCT116（p53+/+,p21+/+)第61頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三D.E.0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hr24hrH2AH4GAPDHTimeaferGFP-p21inductionH1H2BH3InhibitionofCDKactivitydispersesNPATfromhistonegenepromotersanddown-regulateshistonegeneexpression第62頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三A.0204060801001200468101214Timeafterirradiation(hr)%controlSphaseH1H2AH2BH4H2AH4GAPDHH2BH10hr4hr6hr8hr10hr12hr14hrTimeafterirradiationHCT116（p53-/-,p21+/+)Down-regulationofhistonegeneexpressioninducedbyDNAdamagedependsonp53andp21第63頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三SphaseH1H2AH2BH4BH2AH4GAPDHH2BH1Timeafterirradiation0hr2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hr020406080100120%control0468101214Timeafterirradiation(hr)2HCT116（p53+/+,p21-/-)Down-regulationofhistonegeneexpressioninducedbyDNAdamagedependsonp53andp21第64頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：真實(shí)反映細(xì)胞處理后mRNA水平的變化敏感性較高缺點(diǎn)：使用同位素不能反映蛋白質(zhì)變化的最終結(jié)果及mRNA變化的原因多用于檢測細(xì)胞內(nèi)較高豐度mRNA的變化實(shí)驗(yàn)過程較為復(fù)雜應(yīng)用：觀察細(xì)胞處理后mRNA水平的變化，以印證蛋白質(zhì)的變化第65頁，共75頁，2023年，2月20日，星期三Nuclei

Run-on原理：迅速冷凍，使細(xì)胞核內(nèi)正在轉(zhuǎn)錄的mRNA復(fù)合體處于凍結(jié)狀態(tài)加入ATP/GTP/CTP/32P-UTP，重新恢復(fù)mRNA的轉(zhuǎn)錄并使之結(jié)束（標(biāo)記凍結(jié)時(shí)