實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

關于實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳第1頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三一、實驗目的與要求了解電泳技術的一般原理學習醋酸纖維素薄膜電泳操作技術測定人血清中各種蛋白質的相對百分含量第2頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三二、實驗原理1.電泳是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現象。在一定pH條件下，不同的蛋白質由于具有不同的等電點而帶不同性質的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離2.影響電泳遷移率的因素：

內在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀

外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現象3.醋酸纖維素溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結構，厚度約為120μm，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現象等優(yōu)點第3頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三4.

經醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經染色可計算出各蛋白質的百分含量。第4頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三三、實驗器材1.DYY-6C型

雙穩(wěn)定時電泳儀和DYY-Ⅲ型電泳槽，均為北京市六一儀器廠生產2.醋酸纖維薄膜（2cm×8cm）3.培養(yǎng)皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.點樣器5.濾紙6.載玻片7.鑷子8.玻棒第5頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三四、實驗試劑巴比妥-巴比妥納緩沖液(pH8.6，0.07mol/L，離子強度0.06)

稱取1.66g巴比妥(AR)和12.76g巴比妥納(AR)，置于三角燒瓶中，加蒸餾水約600ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，置4℃保存，備用。2.血清蛋白染色(1)染色液(0.5％氨基黑10B)：稱取0.5g氨基黑10B，加蒸餾水40ml，甲醇(AR)50ml，冰乙酸(AR)10ml，混勻溶解后置具塞試劑瓶內貯存。(2)漂洗液：取95％乙醇(AR)45ml，冰乙酸(AR)5ml，和蒸餾水50ml，混勻置具塞試劑瓶中貯存。第6頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三五、測試材料未溶血的人或動物血清第7頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三電泳儀由電泳槽和穩(wěn)壓電源兩部分組成，，兩者之間有專門的連線連接。穩(wěn)壓電源用于調節(jié)電壓和通電時間。當電泳槽和穩(wěn)壓電源連接好后，將點好樣的醋酸纖維薄膜搭在濾紙橋上，蓋上蓋子，通電，調整好電壓，進行電泳。注意電泳槽的電極方向，負極應與醋酸纖維薄膜上的點樣原點在同一側。目前，該電泳儀已改進為數顯式的DYY-6C型。浸泡：將2×8cm醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面。在無光澤面距短邊一端1.5cm處用鉛筆輕輕畫一條點樣線，將之置于盛有緩沖液的平皿中，浸泡30min方可用于點樣。點樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內吸干多余的緩沖液，然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。在另一載玻片上滴一滴血清，點樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來回移動一次），再將點樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內，形成均勻的直線。操作指南：第8頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三六、操作步驟1.醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中約30min后，每組取醋酸纖維素薄膜1張，取時用鑷子夾住薄膜一端，放在折疊的濾紙中，并用它吸干表面液體。2.電泳槽的準備電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋。兩桿之間的距離調節(jié)到略小于醋酸纖維薄膜的長度，點好樣的醋酸纖維薄膜就搭在濾紙橋上。第9頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三第10頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三3.點樣：點樣時，先將毛細血管插入血清中，封住上端，在載玻片的一端均勻涂過，使樣品連續(xù)、均勻、適量，把載玻片在薄膜毛面上輕而溫和地印一下。點樣區(qū)距陰極端1.5cm處（見圖）。此步是實驗的關鍵。

醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖（虛線處為點樣位置）第11頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三4.電泳將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關，調節(jié)電流強度0.3mA/cm膜寬度（24片薄膜則為14.4mA）。通電5min后，調節(jié)電流強度0.5mA/cm膜寬度（24片薄膜則為24mA），電泳時間50min。電泳后，調節(jié)旋鈕使電流為零，關閉電泳儀切斷電源。第12頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三5.染色：電泳完畢后將薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5min6.漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數次，直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜。第13頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三7.記錄和分析實驗結果

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄在預習本上，并判斷分析其結果。8.整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺，請老師驗收，實驗報告當場交給老師。第14頁，共16頁，2023年，2月20日，星期三七、注意事項1、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關鍵之一。2、點樣時，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。3、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。4、點樣應點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。5、電泳時應將薄膜的點樣