流式細(xì)胞儀分析技術(shù)應(yīng)用課件

實(shí)驗(yàn)室流式細(xì)胞儀單細(xì)胞分選技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的新技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)最大的特點(diǎn)是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過(guò)熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。細(xì)胞不被破壞，測(cè)量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)（1）液流系統(tǒng)（2）光學(xué)系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。細(xì)胞分選原理細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)不充電充電（一）分選基本原理分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。（二）分選的技術(shù)要求參數(shù)：FS,SS,FL數(shù)據(jù)顯示方式（單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、二維等高圖、假三維等高圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖）設(shè)門分析技術(shù)第二節(jié)數(shù)據(jù)的顯示與分析FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、參數(shù)單參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖:點(diǎn)圖 二維等高圖 假三維等高圖三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析直分析方圖設(shè)門分析:REGION和GATE設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度2.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。二維等高圖3.假三維等高圖（三）三參數(shù)直方圖多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。三、設(shè)門分析技術(shù)A淋巴細(xì)胞B單核細(xì)胞C中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門線性門樣本制備標(biāo)記染色液相芯片技術(shù)質(zhì)量控制第四節(jié)流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求

外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備 分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備蛋白酶消化機(jī)械吹打使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌尼龍網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液一、免疫檢測(cè)樣品制備新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備機(jī)械法酶處理法化學(xué)試劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存深低溫保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）1×PhosphateBufferSalineorHBSS(Ca/Mg++free)1mMEDTA25mMHEPESpH7.01%FetalBovineSerum(Heat-inactivated)SortingBuffer淋巴細(xì)胞：

1xHBSS(withCa++/Mg++)含1%FBS

HBSS配方中的陽(yáng)離子可增加細(xì)胞的生存力。由于這些細(xì)胞并非易于聚集，即便配方中沒(méi)有EDTA也不會(huì)造成問(wèn)題。較黏著的細(xì)胞(stickycells)：

提高EDTA到5mM并使用透析過(guò)的FBS(againstCa++/Mg++freePBS)。某些細(xì)胞在活化會(huì)比較黏著而EDTA可抑制此作用貼壁型細(xì)胞株(Adherentcells)：

以Trypsin處理后去準(zhǔn)備單細(xì)胞懸液時(shí)，待細(xì)胞變圓(切記不可過(guò)度作用)，便以5ml含5%血清培養(yǎng)液收取細(xì)胞，并均勻地打散細(xì)胞懸液。離心后，用sortingbuffer調(diào)整細(xì)胞濃度。如果需要的話，可以提高EDTA的濃度(至5mM)以避免細(xì)胞重新黏聚。含有高比例死細(xì)胞的樣本：

Sortingbuffer加5mMMgCl2以及25~50μg/mLDNAaseI(SigmaD-4513)或是Sortingbuffer加0.83mMMgCl2以及20UDNAaseII(SigmaD-4138)。這些配方可減少因死細(xì)胞釋放出來(lái)的DNA所造成的細(xì)胞黏聚現(xiàn)象。盡量選擇熒光光譜重疊小的熒光素PE-Cy5/APC&PerCP-Cy5.5/APC為弱表達(dá)的抗原選擇較亮的熒光素CD62LonCD8+T防止耦聯(lián)染料降解（光照/固定/升溫等）造成的干擾APC-Cy7/PE-Cy7二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色盡量選擇熒光光譜重疊小的熒光素MinimizethepotentialforspectraloverlapSpilloverestimatesavailableinthespectraviewer2FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類（一）幾種常見(jiàn)的熒光染料名稱染料激發(fā)波長(zhǎng)熒光顏色溶解性對(duì)PH敏感性特點(diǎn)異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制多色分析時(shí)組合抗體的使用原則在免疫表型分析中，常常把多種熒光素標(biāo)記抗體同時(shí)組合在一起進(jìn)行多色分析，但并非多種抗體均可以自由組合在一起使用。在多數(shù)熒光素標(biāo)記抗體組合應(yīng)用之前，必須將每種抗體單獨(dú)應(yīng)用和組合應(yīng)用的結(jié)果進(jìn)行比較，一旦這種組合顯示出與單獨(dú)應(yīng)用時(shí)無(wú)差別的結(jié)果時(shí)，這種組合才可以應(yīng)用于多色免疫表型分析。在單獨(dú)或組合應(yīng)用時(shí)，應(yīng)注意抗體的稀釋度。如3種抗體單獨(dú)使用時(shí)的最佳用量為20μl，而3種抗體組合應(yīng)用時(shí)如果各加20μl，總體積會(huì)增至60μl，因此每種抗體的濃度被稀釋成原來(lái)的1/3，不再是最佳用量。因此組合抗體應(yīng)用濃度應(yīng)比單獨(dú)抗體使用濃度高。一種新的抗體組合設(shè)計(jì)后必須進(jìn)行這種比對(duì)試驗(yàn)，這種組合一旦應(yīng)用與臨床，不可隨便改換抗體組合或抗體的克隆。一般情況下多色分析熒光素標(biāo)記抗體組合最好采用同一種工藝制作的為佳。血液系統(tǒng)單細(xì)胞分選標(biāo)準(zhǔn)化的建立背景干細(xì)胞的研究意義現(xiàn)在已經(jīng)越來(lái)越重要。白血病干細(xì)胞的研究一直走在整個(gè)學(xué)科的前沿，引領(lǐng)學(xué)科的發(fā)展。越來(lái)越多的證據(jù)顯示干細(xì)胞自我更新及分化的分子機(jī)制都是在單細(xì)胞水平上發(fā)生的，單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為干細(xì)胞的研究奠定了重要基礎(chǔ)。現(xiàn)有的單細(xì)胞技術(shù)主要包括單細(xì)胞分選、培養(yǎng)、單細(xì)胞PCR、單細(xì)胞多色Fish、單細(xì)胞基因組及表觀遺傳學(xué)分析、免疫缺陷鼠移植鑒定在內(nèi)的單細(xì)胞技術(shù)。擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題所有的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，干細(xì)胞的單細(xì)胞分選是最為關(guān)鍵，也是最為基礎(chǔ)的一個(gè)環(huán)節(jié)。影響單細(xì)胞分選效果的因素有很多。（比如目的分離細(xì)胞群的不同，分選的儀器選擇，抗體標(biāo)記的染料的選擇，不同熒光顏色之間的補(bǔ)償計(jì)算，樣品的準(zhǔn)備，收集工具的不同等。)單細(xì)胞分選的標(biāo)準(zhǔn)化建立非常重要，尤其我重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究工作主要以血液系統(tǒng)為研究對(duì)象，更加有意義。研究目標(biāo)

通過(guò)對(duì)機(jī)器參數(shù)的調(diào)整，激光功率的確認(rèn)，補(bǔ)償?shù)牧炕幚?，接收工具的模板化和抗體組合的優(yōu)化建立一套針對(duì)白血病干細(xì)胞和正常造血干細(xì)胞的分選標(biāo)準(zhǔn)。研究方法熒光抗體的選擇分選儀器的比較補(bǔ)償計(jì)算的量化精確調(diào)整接收工具的模板標(biāo)準(zhǔn)化單細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定熒光抗體的選擇種屬來(lái)源：人正常造血干細(xì)胞分選標(biāo)記：Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rholow白血病干細(xì)胞的分選標(biāo)記：CD34+CD38-CD71-CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+種屬來(lái)源：鼠正常造血干細(xì)胞分選標(biāo)記:Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flk2-

或者Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-MLL-AF9AML白血病干細(xì)胞的分選標(biāo)記:Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32+CD34+

或c-Kit+Gr-1-BCR-ABLCML白血病干細(xì)胞的分選標(biāo)記:Lin-Sca-1+c-Kit+分選儀器的比較石英杯激發(fā)原理：激光檢測(cè)是在石英杯中進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)：比色皿提供層流和增強(qiáng)的樣品聚焦，對(duì)于敏感性來(lái)說(shuō)，石英杯激發(fā)系統(tǒng)明顯占優(yōu)。缺點(diǎn)：石英杯長(zhǎng)度有限，而且激光光學(xué)裝置需要足夠空間避免不同通道間的串?dāng)_，細(xì)胞需要通過(guò)不同的介質(zhì)，且速度不一樣，高速下細(xì)胞密度變大，與流動(dòng)池和噴嘴接觸面變大，不能保證在液滴延遲時(shí)間內(nèi)到。空氣激發(fā)原理：激光檢測(cè)是在細(xì)胞通過(guò)噴嘴后的液滴中。優(yōu)點(diǎn)：硬件設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)點(diǎn)與收集裝置間距離較短，檢測(cè)樣品的可用的激光數(shù)多，液流更穩(wěn)定，能在高速情況下準(zhǔn)確在液滴延遲時(shí)間內(nèi)到達(dá)。保持細(xì)胞清潔的更好，并且能提供額外的激光束。缺點(diǎn)：對(duì)于敏感性來(lái)說(shuō)，空氣激發(fā)不那么敏感。補(bǔ)償計(jì)算的量化精確調(diào)整

購(gòu)買補(bǔ)償微球（comp-beads），標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中所需要涉及的抗體，孵育后作為單陽(yáng)補(bǔ)償管，進(jìn)行上樣通過(guò)圈門調(diào)整微球群中位數(shù)，修正所有補(bǔ)償。建立良好的補(bǔ)償矩陣，這樣的補(bǔ)償計(jì)算更標(biāo)準(zhǔn)。接收工具的模板標(biāo)準(zhǔn)化

因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的需求不同，所以單細(xì)胞分選到不同接收器中，這其中包括24孔板，96孔板，72孔板乃至384孔板等，在每個(gè)機(jī)器上調(diào)整相應(yīng)模板，使其固定為標(biāo)準(zhǔn)化的模板，每次使用直接調(diào)用，不需要重復(fù)進(jìn)行調(diào)整。這將極大提高分選效率和精確性。單細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定

將分好的單細(xì)胞至于相應(yīng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行14天培養(yǎng)，培養(yǎng)后對(duì)每板細(xì)胞存活比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后對(duì)存活的各孔細(xì)胞向各系進(jìn)行分化趨向的統(tǒng)計(jì)。1細(xì)胞/孔IMDM+10%FBS+SCF100ng/mL+TPO50ng/mL+Flt3L100ng/mL14天檢測(cè)nmEM四系分化：人（CD19，CD33），鼠（Gr-1，Mac-1，Ter119，CD41）技術(shù)路線CD34-PECD38-FITCCD34+CD38-細(xì)胞

1/PE-Isotype;FITC-Isotype:設(shè)置陰性對(duì)照門,去除抗體非特異性吸附的