電泳遷移率實驗技術(shù)EMSA

電泳遷移率實驗技術(shù)（EMSA）主講人：劉東

凝膠遷移實驗又稱凝膠阻滯實驗或電泳遷移率實驗（EMSA，electrophoreticmobilityshiftassay），是一種用于蛋白與核酸相互作用的技術(shù)。最初是用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗，也可應(yīng)用于蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。一、實驗原理

EMSA主要基于蛋白-探針復(fù)合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據(jù)實驗設(shè)計特異性和非特異性探針，當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物；這種復(fù)合物由于分子量大，在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，蛋白-探針復(fù)合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標(biāo)探針發(fā)生互作。二、實驗操作步驟

1、實驗前準(zhǔn)備

（1）合理的實驗方案根據(jù)研究目的合理設(shè)計特異性探針實驗組以及非特異性探針對照組，如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等。（2）樣本制備可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對樣本蛋白進(jìn)行定量，實驗中等量加入蛋白。（3）探針制備根據(jù)實驗要求設(shè)計不同的探針并添加標(biāo)記，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商業(yè)化的抗體也可以直接購買?，F(xiàn)在大多數(shù)實驗室已經(jīng)不再使用放射性標(biāo)記，生物素使用相對較多。蛋白樣本（2-5μg）Xμlpolyd(I-C)1μlBindingBuffer2μlNuclease-FreeddH2OXμl總體積9μl2、形成蛋白-探針復(fù)合物

（1）在0.5ml離心管中按順序?qū)⑾铝薪M份混勻：

（2）冰浴5min后，加入1μl探針。（對照組加1ul對照探針）

（3）PCR儀中室溫（20-23℃）溫育30min。3、制備凝膠，電泳

（1）必須是非變性PAGE凝膠,一般用6.5%的非變性膠.制膠很重要,直接影響電泳的效果!一般控制在5分鐘凝固的效果。(2）加樣前先在預(yù)冷的0.5XTBEbuffer中120V預(yù)電泳10min，電泳完畢后沖洗加樣孔。（3）混合樣本及電泳緩沖液，點樣電泳。（4）將電泳槽置于冰上或者4℃環(huán)境中，恒壓100V進(jìn)行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。（大約50-60min，根據(jù)實際情況調(diào)整電泳時間及電壓；電泳時間不宜過長）10XTBE1.0ml40%Acrylamide(聚丙烯酰氨)3.3mldeionized,sterilewater14.8ml50%Glycerol（甘油）1.0mlTEMED（四甲基乙二胺）10μl脫氣10min10%AP（過硫酸銨）120μl4、轉(zhuǎn)膜

（1）在預(yù)冷的0.5XTBE中浸泡凝膠，膜，濾紙和纖維墊。（2）按如下順序組裝“三明治”：纖維墊，濾紙，凝膠，膜，濾紙，纖維墊。注意電極，確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。（3）在預(yù)冷的0.5XTBE中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜裝置應(yīng)置于冰上或者低溫室中，恒壓60V轉(zhuǎn)膜1h。（注意根據(jù)實際情況調(diào)整電壓及時間）。5、紫外交聯(lián)

紫外交聯(lián)儀是一種多用途的254mm紫外輻射系統(tǒng)主要用于將核酸交為使核苷酸固定在雜交膜上。傳統(tǒng)的方法是將膜置于80℃真空烘箱中烘2小時，在本紫外交聯(lián)儀上僅需在254nm紫外光下照射幾秒鐘即可。·紫外照射可使雜交信號比傳統(tǒng)烘烤法提高5-10倍。5.洗滌、孵育

用WashingBuffer洗滌(整個過程避免膜干燥)倒掉沖洗緩沖液，加入BlockBuffer輕微震蕩20min加入適量的HRP酶標(biāo)記的鏈霉親和素室溫震蕩孵育45min。（勿將酶標(biāo)記物直接加到膜上）去掉酶聯(lián)物稀釋液，用WashingBuffer洗膜三次，每次室溫輕微震蕩10min。配置反應(yīng)底物，均勻加至膜上，室溫孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜輕輕覆蓋在膜上，使底物均勻覆蓋，注意不要產(chǎn)生氣泡）6、曝光成像兩種方法:化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像與檢測和感光膠片沖印成像用TNFa刺激腫瘤細(xì)胞后得到的核蛋白的NFKB的EMSA試驗圖片

操作基本和Western試驗操作相當(dāng),只是這個膜是一次性的,不能重復(fù)使用,一定保存好圖片!由于跑得是非變性凝膠,蛋白保持天然構(gòu)像和活性,所以條帶很可能是一塊一塊的而不像WB那樣很規(guī)整的一條細(xì)線,這個很正常。三、常見問題1、為什么看不到遷移帶？

1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量不足。2）樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。3）探針與蛋白無特異性的相互作用。4）轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。5）曝光或者成像時間過短。2、為什么實驗背景高？

1）曝光或者成像時間過長。2）封閉時間不足或者效率不高。3）洗滌效果不佳4）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。3、EMSA測定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針？

對每一個特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化：一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白:DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白的