細(xì)胞工程基礎(chǔ)(學(xué)時)

第一章細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)細(xì)胞工程當(dāng)前1頁，總共135頁。1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)1細(xì)胞2染色質(zhì)與染色體3細(xì)胞周期4細(xì)胞分裂6組織5有性生殖細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)當(dāng)前2頁，總共135頁。細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)：

1831年，羅伯特·布朗，細(xì)胞核（植物葉片表皮細(xì)胞）；1835年，細(xì)胞質(zhì)（多孔蟲）。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1665年，羅伯特·胡克，命名cell，細(xì)胞壁1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前3頁，總共135頁。細(xì)胞大小與形態(tài)一般10-100微米；形狀多樣：球體，多面體，仿錘體，柱狀體。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前4頁，總共135頁。細(xì)胞的分子組成與結(jié)構(gòu)六種主要元素：O、C、H、N、P、S等；無機(jī)元素；無機(jī)物（水、無機(jī)鹽）、有機(jī)物（糖、脂、蛋白質(zhì)、核酸等）。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前5頁，總共135頁。原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前6頁，總共135頁。植物細(xì)胞

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前7頁，總共135頁。動物細(xì)胞

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前8頁，總共135頁。與微生物相比，植物細(xì)胞有什么特點？細(xì)菌，真菌、植物細(xì)胞都有細(xì)胞壁。細(xì)菌無成形的細(xì)胞核，真菌、植物細(xì)胞有成形的細(xì)胞核。細(xì)菌只有核糖體一種細(xì)胞器。植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大。植物細(xì)胞直徑一般約為10-200μm，平均直徑比微生物細(xì)胞大30-100倍。植物細(xì)胞很少以單一細(xì)胞形式懸浮生長，通常以一定細(xì)胞數(shù)的非均相細(xì)胞團(tuán)方式存在。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前9頁，總共135頁。與微生物相比，植物細(xì)胞有什么特點？植物細(xì)胞具有纖維素細(xì)胞壁和大的液泡，很容易被剪切力損傷與微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞生長速度慢，操作周期長，分批培養(yǎng)一般需要2-3周，半連續(xù)或連續(xù)培養(yǎng)時間一般長達(dá)2-3個月植物細(xì)胞培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜，適合微生物生長，因此防止污染更困難。植物細(xì)胞培養(yǎng)一般需要光照，通過光合作用合成有機(jī)物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對細(xì)胞培養(yǎng)影響較大。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前10頁，總共135頁。細(xì)胞膜細(xì)胞是生命活動的基本單位細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前11頁，總共135頁。膜的特性膜上進(jìn)行著物質(zhì)交換、能量流動和信息傳遞等活動。細(xì)胞膜是一種動態(tài)的結(jié)構(gòu)，具有選擇性、柔軟性、流動性、有序性、自我封閉性等特點。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前12頁，總共135頁。細(xì)胞核主要由核被膜、核質(zhì)、染色質(zhì)和核仁組成。表面有數(shù)目不定的核孔（核孔復(fù)合體）。核孔復(fù)合體—核內(nèi)、核外物質(zhì)和信息交換的通道。染色體—遺傳信息的載體細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前13頁，總共135頁。細(xì)胞和基因生命的本質(zhì)細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前14頁，總共135頁。染色質(zhì)與染色體1879年，W.Flemming提出了染色質(zhì)的術(shù)語；染色質(zhì)指細(xì)胞分裂間期細(xì)胞內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA組成的絲狀復(fù)合結(jié)構(gòu)，是間期細(xì)胞遺傳物質(zhì)的存在方式；染色體是細(xì)胞有絲分裂或減數(shù)分裂過程中，由染色質(zhì)聚成的棒狀結(jié)構(gòu)。核型：指細(xì)胞分裂中期染色體特征的總和，包括染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)特征等細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前15頁，總共135頁。從DNA到染色體形成過程染色體作為基因載體，它的一級結(jié)構(gòu)是由2nm的DNA與組蛋白(histone)結(jié)合形成核小體(nucleosome)，它是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位。每個核小體由組蛋白(H2A、H2B、H3、H4各兩個分子)組成八聚體，外面盤繞1.75圈DNA(約140個堿基對)。

兩個核小體之間以60個堿基對的連接DNA片段相連接形成核小體絲(beads-on-a-string)，在組蛋白HI存在的情況下由6個核小體形成直徑為30nm的螺線管(solenoids)，這是二級結(jié)構(gòu)也是染色體的基本結(jié)構(gòu)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前16頁，總共135頁。從DNA到染色體形成過程

在螺線管上，存在著特異結(jié)構(gòu)和序列的富含“A”、“AT”的非編碼異染質(zhì)DNA，在特異具有黏和性蛋白的作用下，螺線管有序彎曲，折疊排列形成300nm呈梯形排列成為染色體的三級結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步聚縮形成形成300nlTl圓柱體的染色線(chrmotinds)，這是染色體的四級結(jié)構(gòu)，300nlTl圓柱體的染色線上由于黏和蛋白分布不勻使得染色線螺旋化，形成超螺旋中期染色體。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前17頁，總共135頁。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前18頁，總共135頁。細(xì)胞周期分裂期（D期或M期）間期間期G1（復(fù)制前期）S（合成期）G2（復(fù)制后期）按照G1→S→G2→M路線運行細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前19頁，總共135頁。細(xì)胞分裂無絲分裂：簡單的細(xì)胞分裂方式，只出現(xiàn)在低等生物或動植物的器官內(nèi)，以橫裂或縱裂方式進(jìn)行。有絲分裂：細(xì)胞分裂的主要方式，染色體經(jīng)過復(fù)制，平均分配到兩個子細(xì)胞中去。包括間期(Interphase)、前期(Prophase)、中期(Metaphase)、后期(Anaphase)和末期(Telophase)。減數(shù)分裂：生殖細(xì)胞分裂方式；一次復(fù)制，兩次分裂。子細(xì)胞染色體數(shù)目比親代細(xì)胞減少了一半。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前20頁，總共135頁。生殖有性生殖（Sexualreproduction）：是兩個配子融合為一，成為合子或受精卵，再發(fā)育成為新一代個體的生殖方式。無性生殖（Asexualreproduction）：不涉及性別、沒有配子參與、沒有受精過程的生殖都屬于無性生殖（Asexualreproduction）。許多高等植物的營養(yǎng)器官（例如根、莖、葉等），在脫離母體后能發(fā)育成完整的植株，這種繁殖方式也稱為營養(yǎng)生殖。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前21頁，總共135頁。植物組織：分生組織，永久組織；細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)位于植物的生長部位，具有持續(xù)或周期性分裂能力的細(xì)胞群，稱為分生組織。分生組織的細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞核相對較大，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞器豐富。根據(jù)分生組織在植物體內(nèi)的位置不同，可將分生組織分為頂端分生組織、側(cè)分生組織和居間分生組織三類

。動物組織：上皮組織，結(jié)締組織，肌肉組織，神經(jīng)組織。組織1.1細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)當(dāng)前22頁，總共135頁。第二節(jié)細(xì)胞全能性及其表達(dá)1細(xì)胞全能性概述2細(xì)胞脫分化3細(xì)胞再分化細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)當(dāng)前23頁，總共135頁。概述一個細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整生物個體的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。細(xì)胞全能性的絕對性與相對性:不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng);即使對于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞全能性也并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物個體;理論上,任何一個生活細(xì)胞都有發(fā)育成完整生物個體的潛在能力，但生活細(xì)胞要表達(dá)全能性必須首先回復(fù)到分生狀態(tài)或胚性細(xì)胞狀態(tài)，而這種回復(fù)能力在不同類型細(xì)胞間具有相當(dāng)大的差異。動、植物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前24頁，總共135頁。概述植物細(xì)胞按照分裂能力分為三類：第一類是始終保持分裂能力，從一個周期進(jìn)入另一個周期的周期細(xì)胞。如莖尖、根尖及形成層細(xì)胞；第二類是永久失去分裂能力的細(xì)胞，為終端分化細(xì)胞。如篩管、導(dǎo)管、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞；第三類是在通常情況下不分裂，但在受到外界刺激后可重新啟動分裂的Go細(xì)胞。表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前25頁，總共135頁。概述

一個植物細(xì)胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進(jìn)行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態(tài)。

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前26頁，總共135頁。概述植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱:

營養(yǎng)生長中心>形成層>薄壁細(xì)胞>厚壁細(xì)胞(木質(zhì)化細(xì)胞)>特化細(xì)胞(篩管、導(dǎo)管細(xì)胞)；

根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱為：

頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導(dǎo)組織>厚壁組織。

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前27頁，總共135頁。概述真核生物是一個具有高度組織結(jié)構(gòu)分工的多細(xì)胞系統(tǒng)，處于生物體內(nèi)的細(xì)胞及由其組成的不同組織均處于高度分化狀態(tài)，以行使不同的生理功能。這些分化的細(xì)胞經(jīng)過分裂只產(chǎn)生組成相應(yīng)組織或器官的細(xì)胞，所以在生物體內(nèi)，細(xì)胞的全能性不能表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞或組織脫離母體后，在適宜的條件下將有利于進(jìn)行一些特殊的發(fā)育方式，如再生、復(fù)壯等“生理脫離效應(yīng)”。細(xì)胞或組織從完整的有機(jī)體上分離下來，以脫離母體的影響，這對于細(xì)胞全能性的表現(xiàn)十分重要。全能性能否成功表達(dá)還取決于人工條件的調(diào)控，這些調(diào)控過程簡單歸納起來就是細(xì)胞的脫分化和再分化。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前28頁，總共135頁。細(xì)胞全能性脫分化再分化細(xì)胞分裂個體再生細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)，是再生的基礎(chǔ)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)概述1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前29頁，總共135頁。概述細(xì)胞分化（Differentiation）：是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。細(xì)胞脫分化（dedifferentiation）：培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程。即分化的細(xì)胞在適宜的條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝誀顟B(tài)而重新獲得分裂能力的過程。再分化（redifferentiation）：在離體條件下，當(dāng)細(xì)胞脫分化以后，無序生長的細(xì)胞及其愈傷組織要重新進(jìn)入有序生長進(jìn)而才能再生個體。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前30頁，總共135頁。概述脫分化與再分化的比較比較內(nèi)容脫分化再分化過程外植體→愈傷組織愈傷組織→幼苗形成體特點排列疏松、高度液泡化的薄壁組織有根、芽需要條件離體適宜的營養(yǎng)生長素/細(xì)胞分裂素的比例適中不需光離體適宜的營養(yǎng)生長素/細(xì)胞分裂素的比例高或低誘導(dǎo)生芽或生根光照細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前31頁，總共135頁。概述操作流程外植體愈傷組織

胚狀體或叢芽完整植株脫分化，不需光再分化，光照生長發(fā)育植物再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：?分化的細(xì)胞——脫分化——再分化離體培養(yǎng)植物組織或細(xì)胞再生植株就是通過細(xì)胞脫分化和再分化實現(xiàn)的。?植物再生的理論基礎(chǔ)：細(xì)胞全能性細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前32頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化細(xì)胞生理與結(jié)構(gòu)變化細(xì)胞脫分化調(diào)控機(jī)理細(xì)胞分裂與愈傷組織形成細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前33頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化--過程中生理和結(jié)構(gòu)變化細(xì)胞脫分化（dedifferentiation）：培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程。即分化的細(xì)胞在適宜的條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝誀顟B(tài)而重新獲得分裂能力的過程。離體培養(yǎng)下，脫分化過程發(fā)生在第一次有絲分裂之前。在植物細(xì)胞中，執(zhí)行一定功能的G0期細(xì)胞接受外界信號后，由于基因的選擇性表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生一系列生理和生化變化，進(jìn)而脫離G0期重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，即完成細(xì)胞脫分化。靜止細(xì)胞啟動分裂是分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志。

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前34頁，總共135頁。薄壁細(xì)胞：

分化細(xì)胞

細(xì)胞核較小，核位于細(xì)胞邊緣，細(xì)胞中央有大的液泡，細(xì)胞體內(nèi)核糖體密度較低，多聚核糖體數(shù)目較少，質(zhì)體為分化程度較高的葉綠體、雜色體、白色體和淀粉體。脫分化細(xì)胞：

細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細(xì)胞中央，細(xì)胞器增加。在這些變化中，液泡蛋白體的出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認(rèn)為是細(xì)胞脫分化的重要特征。

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)細(xì)胞脫分化1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前35頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的階段根據(jù)脫分化細(xì)胞過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的時空順序，細(xì)胞的脫分化過程可分為3個階段：第一階段為啟動階段，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)增生，并開始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)；第二階段為演變階段，此時細(xì)胞核開始向中央移動，質(zhì)體演變成原質(zhì)體；第三階段為脫分化終結(jié)期，細(xì)胞回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞分裂即將開始。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前36頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理1細(xì)胞周期對脫分化的調(diào)控2激素誘導(dǎo)表達(dá)基因與細(xì)胞脫分化3PSK的發(fā)現(xiàn)及其對細(xì)胞脫分化的影響4細(xì)胞脫分化與染色體解凝聚細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前37頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—細(xì)胞周期細(xì)胞脫分化調(diào)控的實質(zhì)即是G0期細(xì)胞回復(fù)到分裂周期的調(diào)控過程20世紀(jì)70年代，研究者發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞G1期中，存在有特定的調(diào)控點，稱為“限制點”（Rpoint）。在這個點之前，如果缺少外界生長信號（通常是肽生長因子）或某些必需的營養(yǎng)成分（如必需氨基酸），細(xì)胞會終止其G1期的進(jìn)程，進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)稱為G0期，一旦補(bǔ)充了所缺少的因子之后，細(xì)胞即會從G0期回到G1期繼續(xù)分裂周期。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前38頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—細(xì)胞周期2001年度的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎獲得者，美國科學(xué)家Hartwell與英國科學(xué)家Hunt和Nurse的工作揭開了這一過程的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和依賴周期蛋白激酶(CDKcyclin-dependentkinase)是兩類主要的調(diào)控分子。細(xì)胞周期運行的動力主要來自CDK，其活性則主要通過cyclin調(diào)節(jié)和依賴周期蛋白抑制子（CKIcyclin-dependentkinaseinhibitor）的負(fù)調(diào)節(jié)。CDK是引擎,cyclin是油門,CKI是剎車。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前39頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—細(xì)胞周期植物細(xì)胞周期的調(diào)控主要有2類CDK（CDKa、CDKb）和2類cyclin（CycB、CycD）。在環(huán)境或激素等外界條件作用下，CycD基因首先表達(dá)生成CycD，在相關(guān)調(diào)節(jié)因子的幫助下CycD與CDKa結(jié)合形成CDKa/CycD復(fù)合體使CDKa活化，進(jìn)而對Rb（G1期限制點調(diào)控分子）磷酸化，使細(xì)胞通過“限制點”進(jìn)入分裂周期。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂周期后，則由CDKb與CycB以及相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白完成從S期到M期的調(diào)控。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前40頁，總共135頁。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—細(xì)胞周期1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前41頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—激素植物激素是離體培養(yǎng)中所必需的條件，因此與植物激素相關(guān)的基因表達(dá)被認(rèn)為是啟動細(xì)胞脫分化的關(guān)鍵。Takahashi等（1989）從一個葉肉原生質(zhì)體cDNA文庫中分離到一個2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）誘導(dǎo)表達(dá)的基因，命名為par。par基因在細(xì)胞從G0期轉(zhuǎn)入S期的早期啟動中具有功能性作用。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前42頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—激素現(xiàn)有研究證明，植物細(xì)胞感受生長素的信號是由生長素受體（auxinreceptor）和生長素分子相結(jié)合，使生長素受體被活化而完成的，這一過程稱為生長素感應(yīng)(perception)。激活的受體可能引起某些特定的反應(yīng)，如某些離子的吸收或釋放、特定蛋白的磷酸化或去磷酸化等，進(jìn)而引起一系列連鎖信號傳導(dǎo)反應(yīng)，最終導(dǎo)致生長素誘導(dǎo)的基因表達(dá)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前43頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—PSKMatsubayashi和Sakagami（1996）在石刁柏葉肉細(xì)胞低密度懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中，首次分離到2個促分裂肽—phytosulfokine-α和β(PSKα,PSKβ)，檢測分析發(fā)現(xiàn)，在同時有NAA（α-萘乙酸）和BA（6-芐基嘌呤）存在的條件下，第一次細(xì)胞分裂發(fā)生在培養(yǎng)96小時，而培養(yǎng)48小時即可檢測到PSKα，在培養(yǎng)基沒有NAA和BA的培養(yǎng)細(xì)胞中，檢測不到PSKα的存在，同時細(xì)胞也停留在G0/G1期而不能啟動分裂，由此推測，PSKα可能介導(dǎo)了與生長素和細(xì)胞分裂素密切相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前44頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—PSK進(jìn)一步研究表明，水稻細(xì)胞質(zhì)膜存在有PSKα的蛋白質(zhì)受體，已分離的蛋白質(zhì)受體為120kD和160kD的膜蛋白。煙草細(xì)胞純化的120kD蛋白為一受體激酶，含有一個胞外富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域和一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，與PSK高度親合，顯示PSK和120kD受體激酶是一活躍的配體－受體對。過量表達(dá)受體蛋白基因，能顯著提高愈傷組織生長。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前45頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化的調(diào)控機(jī)理—PSK煙草葉肉細(xì)胞脫分化過程中染色體有2次解凝聚過程。第一次解凝聚發(fā)生在細(xì)胞壁酶解過程中；第二次解凝聚發(fā)生在原生質(zhì)體在含有生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時；第二次解凝聚對于細(xì)胞進(jìn)入S期是十分重要的，發(fā)生二次解凝聚的細(xì)胞在培養(yǎng)72小時后即進(jìn)入S期，在不含植物激素的培養(yǎng)基中細(xì)胞，染色體不發(fā)生第二次解凝聚，以后迅速死亡。第一次染色體解凝聚是細(xì)胞脫分化的轉(zhuǎn)換過程，通過此過程細(xì)胞關(guān)閉分化狀態(tài)，而第二次解凝聚則是有絲分裂周期銜接過程。細(xì)胞脫分化過程涉及到眾多基因的表達(dá)，染色體解凝聚有利于這些基因的表達(dá)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前46頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成細(xì)胞脫分化是細(xì)胞狀態(tài)的改變，但成功的脫分化必然會導(dǎo)致細(xì)胞分裂；需要采用人工誘導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)體細(xì)胞的脫分化。不同生物的細(xì)胞脫分化能力不同，決定了組織培養(yǎng)再生的難以。在一個細(xì)胞群體培養(yǎng)或組織器官培養(yǎng)體系中，有時很難區(qū)分細(xì)胞脫分化與進(jìn)入增殖狀態(tài)的界限；對于單個細(xì)胞而言，分化細(xì)胞啟動分裂顯然是發(fā)生在細(xì)胞完全脫分化之后；但實驗證明在一個組織和細(xì)胞群體中，細(xì)胞細(xì)胞脫分化和進(jìn)入分裂的過程并非完全同步。細(xì)胞初期分裂方式與外植體細(xì)胞類型有關(guān)，如果外植體細(xì)胞均為正常二倍體細(xì)胞，第一次分裂通常是有絲分裂，如果外植體含有高倍化細(xì)胞，脫分化的第一次分裂可能是無絲分裂。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前47頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成

器官、組織培養(yǎng)時，細(xì)胞分裂首先發(fā)生在傷口部位，以后細(xì)胞分裂逐漸延伸到整個外植體，進(jìn)而形成愈傷組織。

愈傷組織(callus)：愈傷組織原是指植物在受傷以后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞。在組織培養(yǎng)中，則是指外植體在人工培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的無序生長的薄壁細(xì)胞團(tuán)。培養(yǎng)3天培養(yǎng)5天培養(yǎng)7天細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前48頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化與愈傷組織形成脫分化與愈傷組織的形成在性質(zhì)上是不能等同的，脫分化是細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，而形成愈傷組織是離體培養(yǎng)中的一個階段。

盡管細(xì)胞脫分化后進(jìn)入細(xì)胞分裂的結(jié)果，在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但絕不是說所有的細(xì)胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織，許多試驗表明，有些外植體的細(xì)胞脫分化以后直接形成胚性細(xì)胞進(jìn)而形成體細(xì)胞胚。愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞并不是均一未分化的，即同一愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞之間其狀態(tài)存在一定差異，特別是在組織器官培養(yǎng)時，往往出現(xiàn)部分細(xì)胞不完全脫分化的現(xiàn)象，從而使其很容易再分化再生植株，這對培養(yǎng)來說無疑是十分有利的。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前49頁，總共135頁。細(xì)胞再分化細(xì)胞分化（Differentiation）：是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。一個細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機(jī)能，這是在時間上的分化；同一種細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)和機(jī)能，這是在空間上的分化。細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱稱為發(fā)育潛能。單細(xì)胞生物僅有時間上的分化，多細(xì)胞生物的細(xì)胞不但有時間上的分化，而且由于在同一個體上的各個細(xì)胞所處的位置不同，因而發(fā)生機(jī)能上的分工，于是又有空間上的分工。細(xì)胞分化是多細(xì)胞生物個體形態(tài)發(fā)生的基礎(chǔ)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前50頁，總共135頁。細(xì)胞再分化從分化的遺傳控制角度講，細(xì)胞分化是各個處于不同時空條件下的細(xì)胞，基因表達(dá)與修飾差異的反應(yīng)，所以，分化也可以說是相同基因型的細(xì)胞由于基因選擇性表達(dá)所反應(yīng)的各種不同的表現(xiàn)型。在活體內(nèi)，基因表達(dá)由生物體的遺傳性規(guī)定了嚴(yán)格的程序和模式，通過調(diào)節(jié)機(jī)制，決定一細(xì)胞在何時、何地、何種條件下表達(dá)哪一類基因。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前51頁，總共135頁。細(xì)胞再分化細(xì)胞分化的實質(zhì)：是基因的差異表達(dá)（Differentialexpression），是奢侈基因按照一定順序表達(dá)的結(jié)果。在離體條件下，當(dāng)細(xì)胞脫分化以后，無序生長的細(xì)胞及其愈傷組織要重新進(jìn)入有序生長進(jìn)而才能再生個體，因此，通常把離體培養(yǎng)下的這一過程稱為再分化（redifferentiation）。再分化的過程事實上是基因選擇性表達(dá)與修飾的人工調(diào)控過程。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前52頁，總共135頁。細(xì)胞再分化奢侈基因（Luxurygene）：又稱組織特異性基因（Tissue-specificgene），是在各種組織中進(jìn)行不同的選擇性表達(dá)的基因，與各類細(xì)胞的特殊性有直接關(guān)系。持家基因（House-keepinggene）：是維持細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和最低限度功能所不可少的基因，例如：編碼組蛋白、核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖酵解酶等基因。這類基因在所有類型的細(xì)胞中都表達(dá)。細(xì)胞分化是奢侈基因按照一定順序表達(dá)的結(jié)果。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前53頁，總共135頁。1細(xì)胞分化與基因組變化3TE分化及其調(diào)控4激素在細(xì)胞分化中的作用2極性與細(xì)胞分化細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)細(xì)胞再分化1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前54頁，總共135頁。細(xì)胞再分化中的基因組變化在細(xì)胞分化過程中，常見的變化有染色體的反復(fù)復(fù)制，細(xì)胞不分裂；此外DNA的差異擴(kuò)增、基因重排等；基因表達(dá)產(chǎn)物及其調(diào)控與修飾是細(xì)胞分化的本質(zhì)所在。越來越多的研究顯示，細(xì)胞分化主要受基因在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，其中一些特異蛋白基因的表達(dá)調(diào)節(jié)在細(xì)胞分化過程中起到了重要作用。細(xì)胞分化從基因調(diào)控水平上說是奢侈基因（奢侈基因與管家基因）選擇性表達(dá)的結(jié)果，不同類型的奢侈基因的表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞分化產(chǎn)生不同功能的細(xì)胞。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前55頁，總共135頁。極性與細(xì)胞再分化極性（polarity）：植物細(xì)胞分化中的一個基本現(xiàn)象。沒有極性就沒有分化。極性：指植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。極性在高等植物或低等植物中均普遍存在。在很多情況下，細(xì)胞的不均等分裂是是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。極性一旦建立，在一般情況下不可逆轉(zhuǎn)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前56頁，總共135頁。

Fucus(一種大型海藻)合子細(xì)胞不均等分裂及其早期發(fā)育極性建立與質(zhì)膜離子通道的不對稱分布和細(xì)胞周質(zhì)微管重排有關(guān)（Ca2+泵Ca2+通道）。離子通道的不對稱分布又與環(huán)境和重力有關(guān)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)極性與細(xì)胞再分化1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前57頁，總共135頁。TE的形成與細(xì)胞再分化高等植物的維管系統(tǒng)具有水分和營養(yǎng)物質(zhì)運輸、傳遞生物與環(huán)境信息以及機(jī)械支撐以保持植物體的正常形態(tài)等多種功能。TE（TE，trachearyelements，管狀分子）是維管系統(tǒng)的主要成分。通常把離體培養(yǎng)中TE細(xì)胞的出現(xiàn)作為組織分化的標(biāo)志；而極性的建立似乎又是維管發(fā)生的一個信號，極性建立后生長素按極性方向流動，導(dǎo)致TE細(xì)胞分化；由于TE細(xì)胞在分化過程中具有細(xì)胞壁加厚，原生質(zhì)體自溶等易觀察的細(xì)胞特征，從而又為植物細(xì)胞分化研究提供了模式體系。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前58頁，總共135頁。TE的形成與細(xì)胞再分化百日草葉肉細(xì)胞不經(jīng)過分裂而直接通過分化轉(zhuǎn)變?yōu)門E細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)分化（transdifferentiation）。TE細(xì)胞的分化涉及到一系列基因調(diào)控下的復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)過程，包括不同類型基因表達(dá)、激素的極性流動、細(xì)胞骨架的重排、細(xì)胞壁和細(xì)胞器變化等。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前59頁，總共135頁。百日草葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞分化的主要調(diào)控過程三個階段：葉肉細(xì)胞脫分化；脫分化葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化；TE細(xì)胞特化階段。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)TE的形成與細(xì)胞再分化當(dāng)前60頁，總共135頁。由百日草葉肉細(xì)胞分化形成的TE細(xì)胞細(xì)胞壁加厚，原生質(zhì)自溶，細(xì)胞核和細(xì)胞器消失，細(xì)胞骨架呈網(wǎng)狀螺旋排列，整個細(xì)胞變成管狀細(xì)胞。在整個植物體內(nèi)或愈傷組織中，此時TE細(xì)胞長軸兩端穿孔與另一細(xì)胞連通，進(jìn)一步形成完整的疏導(dǎo)組織。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)TE的形成與細(xì)胞再分化1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前61頁，總共135頁。百日草葉肉細(xì)胞向TE分化過程中的基因表達(dá)分析細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)TE的形成與細(xì)胞再分化當(dāng)前62頁，總共135頁。激素對細(xì)胞再分化的調(diào)控作用激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素，其中生長素和細(xì)胞分裂素是兩類主要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長和分化的植物激素。在有些試驗中也顯示，赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）、乙烯（EHT）等也在細(xì)胞分化中起到一定調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前63頁，總共135頁。激素對細(xì)胞再分化的調(diào)控作用1949年，法國植物學(xué)家Camus，把一種菊苣小的營養(yǎng)芽嫁接在其根的組織培養(yǎng)物的上表面，幾天以后，處于芽下的薄壁細(xì)胞中分化出了維管束。這些維管束與芽的維管組織相接在一起。同時，他在愈傷組織表面放置一片玻璃紙，在玻璃紙上再放置芽，切段了愈傷組織與芽之間的直接接觸，結(jié)果維管組織的分化依然發(fā)生。這個試驗表明，芽對維管組織的分化有刺激作用，這種刺激作用必然是由一種或幾種擴(kuò)散性的化學(xué)物質(zhì)引起的。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前64頁，總共135頁。激素對細(xì)胞再分化的調(diào)控作用在眾多植物離體培養(yǎng)中證明，細(xì)胞分裂素和生長素對于細(xì)胞生長和分化具有同等重要的協(xié)同作用，它們的量與比值的不同配合，對細(xì)胞分化起著重要調(diào)節(jié)作用。在離體條件下，如果用生長素和細(xì)胞分裂素處理的順序不同，其作用也不一樣。如果先用生長素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，則有利于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有利于細(xì)胞分化。如果兩者同時處理，則可促使分化頻率的提高。

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前65頁，總共135頁。激素對細(xì)胞再分化的調(diào)控作用Dominov等（1992）從一個煙草的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系中分離到一個同時可被生長素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)表達(dá)的cDNApLS216。在誘導(dǎo)表達(dá)試驗中顯示，只加入生長素（2,4-D，2,4-苯氧乙酸）只引起mRNA短暫積累，而加入外源細(xì)胞分裂素（BA，6-芐基嘌呤）引起的轉(zhuǎn)錄積累雖發(fā)生時間較遲，但可持續(xù)轉(zhuǎn)錄，因此他們也認(rèn)為細(xì)胞分裂素可能增加了細(xì)胞對生長素的敏感性，或者能阻斷生長素的反饋抑制。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前66頁，總共135頁。激素對細(xì)胞再分化的調(diào)控作用另一個生長素誘導(dǎo)表達(dá)基因是p48h-10。在百日草葉肉細(xì)胞培養(yǎng)中，單獨使用IAA時，在培養(yǎng)48小時后才檢測到p48h-10的表達(dá)，而與BA同時使用時，培養(yǎng)24小時即可檢測到該基因地表達(dá)，只使用BA則不能啟動該基因地表達(dá)。組織印跡顯示，p48h-10只在莖和根的維管束中表達(dá)，在分生組織中該基因不表達(dá)（Ye和Varner，1994）。這一結(jié)果較直接的證明了生長素與細(xì)胞分裂素在細(xì)胞分化中的協(xié)同調(diào)控作用。

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前67頁，總共135頁。激素對細(xì)胞再分化的調(diào)控作用除了生長素和細(xì)胞分裂素外，赤霉酸（GA）、乙烯（EL）、脫落酸（ABA）、油菜素內(nèi)酯（BRbrassinosteroid）等植物激素在細(xì)胞分化中的作用也有報道。越來越多的研究顯示，植物激素對細(xì)胞生長與分化的調(diào)控是一個復(fù)雜的級聯(lián)調(diào)控過程，離體培養(yǎng)條件下，由于外植體細(xì)胞所處的生理狀態(tài)不同以及內(nèi)源激素水平的差異，試圖尋找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困難的。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前68頁，總共135頁。細(xì)胞脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細(xì)胞全能性表現(xiàn)的基本過程，了解這一過程的調(diào)控機(jī)理，最終是為再生個體奠定基礎(chǔ)。生物個體形成是通過形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）實現(xiàn)的，建立在離體培養(yǎng)基礎(chǔ)上的形態(tài)發(fā)生稱之為體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生（somaticmorphogenesis）。體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生過程及其調(diào)控機(jī)理是細(xì)胞工程學(xué)研究的核心內(nèi)容。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.2細(xì)胞全能性及其表達(dá)當(dāng)前69頁，總共135頁。1.3器官發(fā)生植物組織培養(yǎng)再生植株的途徑器官發(fā)生途徑：成熟細(xì)胞→愈傷組織→出根出芽→完整植株體細(xì)胞胚發(fā)生途徑：成熟細(xì)胞→分生細(xì)胞→胚狀體→完整植株細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)當(dāng)前70頁，總共135頁。植物的離體器官發(fā)生：指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。在自然界，許多植物的無性繁殖如扦插繁殖、嫁接繁殖，均屬于器官發(fā)生的繁殖方式。但在自然條件下的器官分化過程受植物繁殖本身的自主調(diào)節(jié)控制，而在離體培養(yǎng)條件下，植物細(xì)胞的各種生命活動是在人工輔助調(diào)節(jié)下完成的。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前71頁，總共135頁。1器官發(fā)生方式2器官發(fā)生過程3起始材料對器官分化的影響4激素對器官分化的調(diào)控6光照對器官分化的影響5器官分化的基因調(diào)控（略）細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前72頁，總共135頁。先芽后根先根后芽根芽同步發(fā)生器官發(fā)生方式細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生即先分化芽，芽形成之后，在芽的基部長出根進(jìn)而形成完整植株，這是植物離體培養(yǎng)中較為普遍的一種植株再生方式即先分化根，再在根上產(chǎn)生不定芽進(jìn)而形成完整植株在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株當(dāng)前73頁，總共135頁。經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生器官發(fā)生過程細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前74頁，總共135頁。經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程愈傷組織形成生長中心形成器官原基及器官形成細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前75頁，總共135頁。愈傷組織形成愈傷組織實質(zhì)上是一團(tuán)無序生長的細(xì)胞。處于非分化狀態(tài)的愈傷組織細(xì)胞均為近圓形的液泡化薄壁細(xì)胞。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程1.3器官發(fā)生當(dāng)前76頁，總共135頁。生長中心形成生長中心是愈傷組織中形成器官的部位。處于生長中心的細(xì)胞體積小，細(xì)胞質(zhì)稠密，蛋白質(zhì)合成豐富，液泡逐漸消失。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程1.3器官發(fā)生當(dāng)前77頁，總共135頁。芽形成生長中心形成后，按照其已確立的極性，細(xì)胞開始分化形成管狀細(xì)胞，進(jìn)而形成維管組織。生長中心部位開始形成不同的器官原基，進(jìn)而分化出相應(yīng)的組織和器官。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生過程1.3器官發(fā)生當(dāng)前78頁，總共135頁。不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生在有些情況下，外植體不經(jīng)過典型的愈傷組織即可形成器官原基，這一途徑有兩種情況：一是外植體中已存在器官原基，進(jìn)一步培養(yǎng)即形成相應(yīng)組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。另一種情況是外植體某些部位的細(xì)胞在重新分裂后，直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。這種不經(jīng)過愈傷組織直接發(fā)生器官的途徑在以品種繁殖為目的的離體培養(yǎng)中具有重要的實踐意義。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前79頁，總共135頁。莖尖培養(yǎng)中芽形成外植體直接發(fā)生芽細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生1.3器官發(fā)生當(dāng)前80頁，總共135頁。a.細(xì)胞第一次平周分裂b.一個子細(xì)胞連續(xù)幾次分裂,生長中心形成c.原初分生組織d.芽原基形成非洲紫羅蘭葉片直接發(fā)生不定芽的組織學(xué)變化細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)不經(jīng)過愈傷組織的器官發(fā)生1.3器官發(fā)生當(dāng)前81頁，總共135頁。外植體的類型母體植物的遺傳基礎(chǔ)起始材料對器官分化的影響細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前82頁，總共135頁。起始材料對器官分化的影響總體上說，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培養(yǎng)成功的報道最多。通常情況下，自然繁殖以無性繁殖為主的植物在培養(yǎng)條件下也有較強(qiáng)的器官分化的能力。同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果具有較大差異已是不爭的事實。無論是單子葉植物還是雙子葉植物，基因型對于培養(yǎng)反應(yīng)的差異都存在，其中器官分化能力的差異大于愈傷組織誘導(dǎo)的差異。組織培養(yǎng)反應(yīng)的差異的現(xiàn)象稱為頑拗性(recalcitrate)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前83頁，總共135頁。不同基因型大豆上胚軸器官分化能力基因型（品種/自交系）

愈傷組織誘導(dǎo)率（％）器官分化率（％）資料來源

汾豆339434程林梅等，2001晉豆199328晉遺219122晉豆119320汾豆389323汾豆179323汾豆519216晉早1259112細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)起始材料對器官分化的影響1.3器官發(fā)生當(dāng)前84頁，總共135頁。玉米不同自交系幼胚培養(yǎng)器官分化能力基因型愈傷組織誘導(dǎo)率（％）

器官分化率（％）

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34010078杜娟等，2002792210086Mol17100624112100538902100578461003847710047吉85310011吉921100324441000.4細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)起始材料對器官分化的影響1.3器官發(fā)生當(dāng)前85頁，總共135頁。外植體的類型對器官分化的影響外植體對誘導(dǎo)反應(yīng)及其再生能力的影響還體現(xiàn)在生理狀態(tài)上來源于生長活躍或生長潛力大的組織、器官的細(xì)胞更有利于培養(yǎng)對于多年生植物而言，以幼嫩組織為材料無論是誘導(dǎo)還是分化均較容易。有性繁殖植物在通常情況下以胚或幼嫩果實為外植體較好，一、二年生無性繁殖植物的取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成功。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前86頁，總共135頁。外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時甚至影響分化的程度和器官類型?；ㄖΡ砥ぃ夯ㄑ繝I養(yǎng)芽，花芽基部表皮：營養(yǎng)芽TranThanhVan等，1974在有些情況下，外植體的取材方式還影響植株的再生途徑：梧桐培養(yǎng)：①取帶腋芽的嫩莖段為外植體，以器官發(fā)生方式再生植株；②取不帶腋芽的莖段為外植體，以體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前87頁，總共135頁。激素對器官發(fā)生的影響激素對器官分化的影響離體培養(yǎng)下的器官分化在大多數(shù)情況下是通過外源提供適宜的植物激素而實現(xiàn)的。在眾多的植物激素中，生長素與細(xì)胞分裂素是2類主要的植物激素，在離體器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位。GA(赤霉酸),PSK(促分裂肽)在器官分化中也具有一定調(diào)控作用。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前88頁，總共135頁。激素對器官分化的影響生長素/細(xì)胞分裂素高有利于根分化生長素/細(xì)胞分裂素低有利于芽分化生長素與細(xì)胞分裂素必須協(xié)調(diào)使用才能再生正常個體細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前89頁，總共135頁。激素對器官分化的影響離體培養(yǎng)中，外源激素在細(xì)胞內(nèi)的吸收和代謝影響到激素的活性從而影響其培養(yǎng)效果。外源細(xì)胞分裂素被外植體吸收后，在細(xì)胞內(nèi)被修飾和轉(zhuǎn)化形成活化形式和鈍化形式。一般認(rèn)為，細(xì)胞分裂素自由堿基形式是活性形式，而核苷形式為鈍化形式。通過細(xì)胞分裂素氧化酶對側(cè)鏈的修飾可能是植物組織細(xì)胞中降低細(xì)胞分裂素活性的主要機(jī)制，在煙草細(xì)胞培養(yǎng)中使用二氫玉米素比使用玉米素更為有效，可能與二氫玉米素核糖苷不是細(xì)胞分裂素氧化酶的底物有關(guān)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前90頁，總共135頁。激素對器官分化的影響生長素進(jìn)入細(xì)胞后，一部分以游離狀態(tài)存在，另一部分則與氨基酸結(jié)合形成生長素－氨基酸復(fù)合體。與生長素結(jié)合的氨基酸主要為天門冬氨酸，也有谷氨酸。2,4-D、NAA、IAA是常用的3種生長素。Ribnicky等（1996）的研究顯示，由于生長素種類不同，形成生長素－氨基酸復(fù)合體的量具有顯著差異，從而亦表現(xiàn)出作為外源生長素在培養(yǎng)效果上的差異。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前91頁，總共135頁。外源生長素在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)細(xì)胞中的總量和游離生長素含量*培養(yǎng)時間外源生長素濃度生長素游離形式（ng/gFW）總濃度（ng/gFW）1周2,4-DNAA[2H4]IAA23,247.4±3,912.799.3±9.730.3±3.521,979.4±2,526.31,776.7±50.17,557.0±279.04周2,4-DNAA[2H4]IAA20,003.8±4,365.964.8±17.53.4±1.433,119.4±3,835.01,637.0±509.8763.5±420.0*引自Ribnicky等1996。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)激素對器官分化的影響1.3器官發(fā)生當(dāng)前92頁，總共135頁。基因調(diào)控homebox細(xì)胞周期基因其它細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前93頁，總共135頁?；蛘{(diào)控—同源框同源框（homebox）基因是涉及到多細(xì)胞生物組織形態(tài)建立的一類同源異型基因。Kn1（KNOTTED1）是從玉米中鑒定出的第一個植物homebox基因，Kn1-likehomebox（knox）基因又可分為2組（classI和classII），classIIknox在各種分化組織器官中均表達(dá)，而classIknox只在分生組織中表達(dá)。在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，大量不定芽生成的部位也檢測到KN1基因的大量表達(dá)。在一些轉(zhuǎn)Kn1相似基因地研究中表明，轉(zhuǎn)基因植株能大量產(chǎn)生復(fù)合芽以及不定分生組織。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前94頁，總共135頁。基因調(diào)控—同源框STM（SHOOTMERISTEMLESS）基因以及它們的直系同源（orthologues）基因均參與了莖尖分生組織的分化調(diào)控。在轉(zhuǎn)Homeobox相關(guān)基因的煙草植物中還檢測分析到赤霉素含量減少和生長素含量上升的內(nèi)源激素變化，這也暗示，Homeobox基因可能通過一些調(diào)節(jié)因子（如激素）介導(dǎo)調(diào)控器官分化。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前95頁，總共135頁。基因調(diào)控—細(xì)胞周期基因細(xì)胞分裂周期基因參與了發(fā)育調(diào)控。植物編碼細(xì)胞周期依賴性激酶基因cdc2在離體培養(yǎng)中，調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入分裂狀態(tài)的過程起著關(guān)鍵性作用，在玉米和大麥離體培養(yǎng)中，cdc2的表達(dá)高峰發(fā)生在不定芽形成的過程中，在培養(yǎng)初期的表達(dá)量較少，同時，該基因的表達(dá)部位處于分生組織的外層細(xì)胞，因此認(rèn)為，cdc2基因?qū)Ψ稚M織的形成和維持分生組織狀態(tài)均有重要作用。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前96頁，總共135頁。基因調(diào)控—細(xì)胞周期基因Banno等（2001）從擬南芥根培養(yǎng)再生芽的體系中克隆了一個增強(qiáng)芽再生能力的基因ESR1，將該基因與35S啟動子連接轉(zhuǎn)化擬南芥，在有細(xì)胞分裂素存在的情況下轉(zhuǎn)基因外植體可以顯著提高不定芽的分化率。而生長素不能誘導(dǎo)該基因表達(dá)，同樣也不能提高不定芽分化頻率。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前97頁，總共135頁?；蛘{(diào)控—細(xì)胞周期基因從擬南芥中鑒定出3個與離體器官發(fā)生有關(guān)的基因SRD1、SRD2和SRD3，當(dāng)它們發(fā)生隱形突變時，在離體培養(yǎng)中表現(xiàn)出器官發(fā)生在不同時期受阻，3個基因均定位于擬南芥I號染色體上。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前98頁，總共135頁?；蛘{(diào)控—細(xì)胞周期基因Low等（2001）通過RT-PCR技術(shù)克隆了一個含有亮氨酸拉練基因bZIP（PKSF1），該基因編碼一個亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)發(fā)生在芽形成之前，在有不

定芽形成的愈傷組織

中其表達(dá)量比非分化

愈傷組織高6倍。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前99頁，總共135頁。光照對器官分化的影響光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時間、強(qiáng)度以及光質(zhì)對器官分化均有影響。離體培養(yǎng)中光照的控制一般是分階段進(jìn)行的，誘導(dǎo)培養(yǎng)中通常不給光照或只提供弱的散射光，以有利于愈傷組織的形成。進(jìn)入分化階段后，則給予較強(qiáng)的光照，光照時間一般為每天14-16小時。連續(xù)的光照有利于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期則有利于極性建立和形態(tài)發(fā)生。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前100頁，總共135頁。光照對器官分化的影響培養(yǎng)條件下，光合作用能力較弱，光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。光照對器官發(fā)生的調(diào)節(jié)可能與調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的內(nèi)源激素平衡有關(guān)，光照還可能影響生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)整生長素的極性運輸，從而引起器官分化。光質(zhì)對器官分化的影響可能與光受體精確調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.3器官發(fā)生當(dāng)前101頁，總共135頁。離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。這一定義有以下幾方面的界定：其一，體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚；其二，體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚；其三，體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別于離體培養(yǎng)中器官發(fā)生形成個體的途徑。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前102頁，總共135頁。體細(xì)胞胚的形成體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素體細(xì)胞胚發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ)細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前103頁，總共135頁。直接途徑間接途徑體細(xì)胞胚的形成細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前104頁，總共135頁。1.誘導(dǎo)階段2.胚胎發(fā)育階段由瘤狀突起發(fā)育形成的早期體細(xì)胞胚(球形胚、心形胚)在含植物激素的培養(yǎng)基上，經(jīng)過20天培養(yǎng)，在傷口和葉片表層細(xì)胞首先啟動細(xì)胞分裂,形成小的瘤狀突起。在葉片上直接形成的體細(xì)胞胚體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生從外植體某些部位直接誘導(dǎo)分化出體細(xì)胞胚蘭草葉片體細(xì)胞胚直接形成過程細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前105頁，總共135頁。經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚形成經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成間接發(fā)生細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前106頁，總共135頁。誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球性胚形成子葉胚期3個階段：誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織，誘導(dǎo)愈傷組織胚性化，體細(xì)胞胚形成。蝴蝶蘭莖段外植體經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚發(fā)生：高濃度2,4-D培養(yǎng)基低濃度2,4-D培養(yǎng)基細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前107頁，總共135頁。愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞團(tuán)球性胚形成成熟子葉胚（1）（2）（3）(1)高濃度2,4-D，(2)低濃度2,4-D，(3)無2,4-D成簇成團(tuán)的體積小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞，具有成胚能力。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前108頁，總共135頁。體細(xì)胞胚形成的細(xì)胞學(xué)觀察表明，其培養(yǎng)物中存在兩種類型的細(xì)胞：

一是自由分散在培養(yǎng)基中的大而高度液泡化的細(xì)胞，這類細(xì)胞一般不具備胚胎發(fā)生潛力；

二是成簇成團(tuán)的體積小而細(xì)胞質(zhì)致密的細(xì)胞，這類細(xì)胞具有成胚能力，因而，把這類細(xì)胞團(tuán)又稱為胚性細(xì)胞團(tuán)。胚性細(xì)胞團(tuán)在增殖培養(yǎng)基上可以連續(xù)增殖，其增殖方式是通過細(xì)胞增殖和細(xì)胞團(tuán)離散進(jìn)行的。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成當(dāng)前109頁，總共135頁。在一個胚細(xì)胞團(tuán)中包括有兩種細(xì)胞：

處在中央的那些細(xì)胞具有一個大液泡，小而致密的核，核仁染色較淺，核糖體數(shù)目不多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體少，無泡囊，脫氫酶活性很低，淀粉粒少；在胚性細(xì)胞團(tuán)的外圍，則是成群的非?；钴S的分生細(xì)胞，這些細(xì)胞的特點是具有若干個小液泡，一個大的細(xì)胞核，一個染色鮮明的核仁，核糖體密度較高，具大量的粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及泡囊，脫氫酶活性較高，含有十分明顯的淀粉粒。胚性細(xì)胞團(tuán)的外圍細(xì)胞不斷分裂，而中央細(xì)胞體積逐漸增大，彼此分離，從而引起胚性細(xì)胞團(tuán)解體，這時外圍分生細(xì)胞離散成新的小細(xì)胞團(tuán)，每一個小細(xì)胞團(tuán)又發(fā)育成一個新的胚性細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成當(dāng)前110頁，總共135頁。體細(xì)胞胚發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)特點體細(xì)胞胚的發(fā)育與結(jié)構(gòu)特點細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前111頁，總共135頁。體細(xì)胞胚大多首先起源于一個胚性細(xì)胞，胚性細(xì)胞經(jīng)過首次分裂形成二細(xì)胞原胚，以后經(jīng)過細(xì)胞分裂形成多細(xì)胞原胚。在單子葉植物中，胚性細(xì)胞的第一次分裂一般為不均等分裂；在雙子葉植物中，胚性細(xì)胞的第一次分裂有不均等分裂，也有均等分裂。在大多數(shù)情況下，胚性細(xì)胞的第一次分裂為平周分裂，形成的２個子細(xì)胞，處于上部的頂細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚，而下部基細(xì)胞成為胚柄類似物。體細(xì)胞胚發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前112頁，總共135頁。類似于植物合子胚的發(fā)育早期原胚發(fā)生胚性細(xì)胞發(fā)生球形胚形成完整胚結(jié)構(gòu)形成膨大的細(xì)胞核從外植體直接發(fā)生體細(xì)胞胚葉片亞表層細(xì)胞進(jìn)行幾次活躍的平周分裂，然后胚性細(xì)胞在這些活躍分裂的細(xì)胞層中產(chǎn)生。胚性細(xì)胞經(jīng)過幾次分裂形成原胚，原胚通常包埋在亞細(xì)胞層中。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前113頁，總共135頁。類似于動物胚胎早期的發(fā)育胚性細(xì)胞發(fā)生發(fā)育早期2次均等分裂早期球形胚形成4個細(xì)胞原胚從愈傷組織間接發(fā)生體細(xì)胞胚完整結(jié)構(gòu)的早期體細(xì)胞胚胚性細(xì)胞既可起源于表層細(xì)胞，也可起源于亞表層細(xì)胞細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前114頁，總共135頁。結(jié)構(gòu)特點與器官發(fā)生形成個體的途徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生植株有兩個明顯特點：一是體細(xì)胞胚具有雙極性（doulblepolarity）；二是體細(xì)胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)聯(lián)系較少，即出現(xiàn)所謂的生理隔離（physiologicalisolation）現(xiàn)象。很容易與原組織分離。在懸浮培養(yǎng)中，到后期可見許多體細(xì)胞胚漂浮在液體培養(yǎng)基中。固體培養(yǎng)時，可觀察到體細(xì)胞胚從外植體或愈傷組織上脫落的現(xiàn)象。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前115頁，總共135頁。體細(xì)胞胚的發(fā)育過程與合子胚基本相同但與合子胚比較：合子胚在發(fā)育初期具有明顯的胚柄，而體細(xì)胞胚一般沒有真正的胚柄只有類似胚柄的結(jié)構(gòu)。合子胚的子葉是相當(dāng)規(guī)范的，可以作為分類的依據(jù)，體細(xì)胞胚的子葉常不規(guī)范。與相同植物比較體細(xì)胞胚的體積明顯小于合子胚，在一些貯藏物質(zhì)的含量上也存在較大差異。并且，體細(xì)胞胚不能有明顯的脫水干燥過程。合子胚在胚胎發(fā)育完全進(jìn)入子葉期胚以后，經(jīng)過一系列的物質(zhì)積累和脫水就進(jìn)入休眠，而體細(xì)胞胚沒有休眠，則直接形成植株，在不同的培養(yǎng)條件和植株種類中，形成植株的胚胎時期有所不同，一般在心形期以后的各個階段均可直接發(fā)育成小植株。

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前116頁，總共135頁。影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素

激素的調(diào)控作用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響基因型的影響細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前117頁，總共135頁。影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素—激素2,4-D是應(yīng)用最為廣泛的生長素。2,4-D的應(yīng)用有著規(guī)律性的變化，首先是在較高濃度下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成，然后在降低2,4-D的濃度下產(chǎn)生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生長素有利于體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育。現(xiàn)有研究證明，在球形胚期形成的生長素極性運輸對于體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育尤為重要，如果球形胚阻斷生長素的極性運輸或改變生長素的極性運輸方向，均會影響體細(xì)胞胚的正常發(fā)育。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前118頁，總共135頁。影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素—激素細(xì)胞分裂素對體細(xì)胞胚發(fā)育的影響研究報道較少，但幾乎所有的有關(guān)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)基配方中，均有細(xì)胞分裂素的配合使用。細(xì)胞分裂素在促進(jìn)細(xì)胞分裂，維持細(xì)胞活躍生長中具有重要生理功能，而完成體細(xì)胞胚胎發(fā)育細(xì)胞分裂是基本前提，當(dāng)胚胎結(jié)構(gòu)建立后，細(xì)胞分裂素對于維持分生組織正常發(fā)育具有重要作用。

細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前119頁，總共135頁。影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素—培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中的氮源亦會顯著影響離體條件下的胚胎發(fā)生，據(jù)Halperin和Wetherell的報道，體細(xì)胞胚的產(chǎn)生要求培養(yǎng)基中含有一定濃度的還原態(tài)氮。Vesco和Guerra在Feijoa植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的試驗也證明，培養(yǎng)基氮源影響體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。在NH4+和NO3-（15:34）的培養(yǎng)基中，每個外植體的體細(xì)胞胚可達(dá)10個以上，而培養(yǎng)基只有NH4+或NO3-時，體細(xì)胞胚發(fā)生頻率很低。一些氨基酸可以代替還原態(tài)氮的作用，上述Feijoa植物的體細(xì)胞胚培養(yǎng)體系，在只含NO3-的培養(yǎng)基中，如果加入4mM的甘氨酸，可以顯著提高體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前120頁，總共135頁。影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素—培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件一些體細(xì)胞胚規(guī)模生產(chǎn)模式的試驗還發(fā)現(xiàn)，球形胚形成后，如果降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可以顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育。Choi等（2002）在西伯利亞人參（E.senticosus）培養(yǎng)中證明，在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可顯著提高體細(xì)胞胚的成苗率。在一些試驗中還發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚發(fā)育后期降低蔗糖濃度，也有利于胚的繼續(xù)發(fā)育和提高體細(xì)胞胚的成苗率。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前121頁，總共135頁。Lee等（2001）在改進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚生產(chǎn)程序的試驗中，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入減少濃度的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，結(jié)果顯示，當(dāng)胚性愈傷組織形成后，在只含1/2MS無機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基中，體細(xì)胞胚形成可以比在MS培養(yǎng)基中高3－4倍。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素—培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件當(dāng)前122頁，總共135頁。Choi等（2002）在西伯利亞人參（E.senticosus）培養(yǎng)中也證明，在體細(xì)胞胚培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，可顯著提高體細(xì)胞胚的成苗率。細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素—培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件當(dāng)前123頁，總共135頁。馬鈴薯不同基因型體細(xì)胞胚形成能力比較細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素—基因型體細(xì)胞胚的產(chǎn)生在不同類型的植物間具有明顯差異。即使是同類植物的不同基因型，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的難易、形成時間以及單個外植體產(chǎn)生體細(xì)胞胚的數(shù)量上也存在明顯差異。當(dāng)前124頁，總共135頁。內(nèi)源激素調(diào)控基因特異蛋白體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ)細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前125頁，總共135頁。外源生長素對體細(xì)胞胚產(chǎn)生和發(fā)育的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的合成、代謝、極性運輸和平衡而起作用的。Ribnicky等在胡蘿卜上胚軸培養(yǎng)中證明，體細(xì)胞胚形成初期細(xì)胞內(nèi)具有較高濃度的游離態(tài)生長素，外源2,4-D和NAA比IAA誘導(dǎo)體細(xì)胞胚效果好，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)初期，細(xì)胞內(nèi)高濃度的游離生長素是必要條件，直接添加外源IAA對其合成有反饋抑制，從而也影響體細(xì)胞胚的形成，而2,4-D對IAA的合成不存在反饋抑制，其結(jié)果也提高了體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率。水稻胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)也證明，高濃度的2,4-D引誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IAA含量升高，當(dāng)加入外源IAA或阻止細(xì)胞內(nèi)IAA滲出而提高細(xì)胞內(nèi)IAA含量時，均可促進(jìn)胚性愈傷組織形成。

內(nèi)源激素細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生當(dāng)前126頁，總共135頁。胡蘿卜胚發(fā)育過程中內(nèi)源IAA的變化發(fā)育時期胚大?。é蘭）IAA濃度（ng/gFW）自由態(tài)結(jié)合肽總含量受精前子房受精前子房受精后子房受精后子房球形胚晚期/心形胚早期魚雷形胚早期魚雷形胚晚期

75-12575-125125-225400-500900-110015±428±5608±69504±522060±69624±527±42257±4241962±5634986±5951063±4827490±3440824±386796±2922272±4131990±4835594±5821567±4639550±4126848±392823±289細(xì)胞工程-細(xì)胞工程基礎(chǔ)1.4體細(xì)胞胚胎發(fā)生內(nèi)源激素當(dāng)前127頁，總共135頁。生長素不僅影響體細(xì)胞胚的早期發(fā)生，同時也影響體細(xì)胞胚的后期發(fā)育。生長素對體細(xì)胞胚后期發(fā)育的影響是通過極性運輸實現(xiàn)的。在合子胚的發(fā)育中，這種極性運輸嚴(yán)重影響胚形態(tài)的建立。Liu等（1993）利用擬南芥幼胚培養(yǎng)體系，揭示了生長素極性運輸由球形胚期的軸向?qū)ΨQ轉(zhuǎn)向心形胚期的兩側(cè)對稱的過程，如果這一過程受阻，則