全血的提取及電泳演示文稿

全血的提取及電泳演示文稿當(dāng)前1頁，總共32頁。1.實(shí)驗(yàn)原理DNA一、全血DNA的提取當(dāng)前2頁，總共32頁。當(dāng)前3頁，總共32頁。由于血液各組分成分顆粒大小及比重不同，利用明膠的吸附作用，使紅細(xì)胞沉積在管底，從而與白細(xì)胞相分離。通過SDS的破膜（細(xì)胞膜和核膜）作用，使白細(xì)胞釋放出DNA。然后利用酚和氯仿抽提純化，分離去除蛋白質(zhì)。最后用乙醇沉淀洗出DNA。當(dāng)前4頁，總共32頁。2.材料與方法⑴.材料用含抗凝劑的采血管進(jìn)行采血，抗凝劑一般有EDTA和肝素，EDTA更好一些，不會(huì)影響下游的反應(yīng)。每5ml的血液中加入0.4ml0.04MEDTA配好的EDTA溶液，顛倒混勻即可。保存于-20℃至-80℃，最好在2個(gè)月內(nèi)提取。

當(dāng)前5頁，總共32頁。3%明膠，TES，Tris飽和酚（pH7.8），氯仿：異戊醇（24:1），無水乙醇，TE離心機(jī)，7ml離心管，1.5mlEP管，中試管，移液器當(dāng)前6頁，總共32頁。⑵方法：Ⅰ提取WBC取1ml全血等體積3%明膠37℃靜置，5·10min取上清3000r/min離心，5min棄上清顛倒混勻溶液顏色均一溶液顏色上下分層沉淀顏色為紅色當(dāng)前7頁，總共32頁。Ⅱ破碎WBC加入2mlTES加10滴10%SDS輕輕敲擊管底震蕩混勻顛倒混勻溶液全部變?yōu)榉奂t色溶液顏色變暗當(dāng)前8頁，總共32頁。Ⅲ抽提DNA加等體積Tris飽和酚顛倒混勻，50次，3000rpm，離心5min取下層酚溶液，混勻后溶液變?yōu)榫坏淖厣∩锨寮拥润w積氯仿：異戊醇（24:1）將上清移入試管顛倒混勻，50次3000rpm，離心5min混勻后溶液變?yōu)榫坏娜榘咨锨逡梗―NA）蛋白質(zhì)層酚溶液上清夜（DNA）蛋白質(zhì)層氯仿溶液當(dāng)前9頁，總共32頁。Ⅳ沉淀DNA加2.5倍無水乙醇吸出絮狀沉淀到1.5mlEP管揮干至無色液體通風(fēng)櫥內(nèi)放置5min加入100μ?ddH2O溶解緩慢加入后，上下均為無色，但有分層面；吸取上層乙醇，輕輕吹打下層（油狀）混勻。無水乙醇與水溶液交界面特點(diǎn)：1.氣泡2.白色絮狀沉淀當(dāng)前10頁，總共32頁。二、瓊脂糖凝膠電泳⑴瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定以及純化DNA或者RNA分子的方法。⑵這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。1.原理當(dāng)前11頁，總共32頁。⑶電泳介質(zhì)瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷鍵相連形成的線狀高聚物。沸水中溶解，45℃開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大?。讖椒秶鷱?0nm到大于200nm）決定于瓊脂糖的濃度。當(dāng)前12頁，總共32頁。⑷.DNA分子的電荷效應(yīng)：

DNA在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動(dòng)。DNA帶凈電荷量的多少與電流強(qiáng)度，電泳緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度有關(guān)。當(dāng)前13頁，總共32頁。⑸.DNA瓊脂糖電泳的分子篩效應(yīng)：在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小、構(gòu)型和瓊脂糖的濃度是主要的影響因素。①DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。M12345當(dāng)前14頁，總共32頁。②當(dāng)前15頁，總共32頁。③瓊脂糖的濃度當(dāng)前16頁，總共32頁。①示蹤染料：有致癌性:EB，吖啶橙等;

無毒的染料：goldviewI核酸染料等⑹.示蹤染料和分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物EBgoldview當(dāng)前17頁，總共32頁。②分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）當(dāng)前18頁，總共32頁。⑴實(shí)驗(yàn)材料：

全血基因組總DNA⑵.實(shí)驗(yàn)試劑：瓊脂糖5×TAE電泳緩沖液6×電泳載樣緩沖液（6×loadingdye）：

0.25％溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于4℃。goldviewI型核酸染料：每10μlDNA加入2μl染料。3.實(shí)驗(yàn)材料和試劑當(dāng)前19頁，總共32頁。⑶.實(shí)驗(yàn)儀器當(dāng)前20頁，總共32頁。凝膠成像系統(tǒng)當(dāng)前21頁，總共32頁。4.操作步驟⑴.制膠1.0%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE⑵.上樣上樣緩沖液⑶.電泳100V，20min⑷.觀察紫外燈下觀察當(dāng)前22頁，總共32頁。溶膠當(dāng)前23頁，總共32頁。上樣準(zhǔn)備DNA:8μl6×loadingdye:2μlTotal:10μl分別吸取上述體積的DNA和6×loadingdye，至透明膠布的光滑表面，用移液器吹打均一。當(dāng)前24頁，總共32頁。凝膠冷卻至50℃，加goldviewI2μl搖勻當(dāng)前25頁，總共32頁。凝膠凝固后取出梳子當(dāng)前26頁，總共3