2-DE常見問題及解決方法

-.z.上一個專題"2D實例分析〔2DTroubleshooting)和超強技術支持〞在發(fā)出后得到了版主和戰(zhàn)友們的支持，在大家的共同探討中，對于2D其中的很多問題都有了很多新的認識。與此同時，我上次發(fā)的專題中所提到的實例很多都是局部，而沒有全圖，所以一些戰(zhàn)友在分析自己的膠圖結果的時候，無法很好的對號入座，所以才決定再推出這個"2DTroubleshooting實例分析第二波：從樣本制備到結果分析〞。同樣也是翻譯自GEHEALTH的專家一次講座的PPT，然后加上我自己的一些聽后的感想和心得。

這個專題的重點在于通過大量完整的2D膠整圖實例，在從樣本制備的過程到結果分析中，不同的處理方式〔如鹽離子濃度，不同范圍的IPG膠條，以及樣品成分，試劑污染的影響〕所造成的后果的比擬，來說明我們實驗中所需要注意的一些問題，并且能夠更好的與實驗中的一些不理想的2D膠對號入座，更快更好的找出需要改良的地方。

但是這個專題的目標并不是說2D有多么多么重要，因為現在對于蛋白質組學的研究，隨著目標蛋白的特異性的逐漸增加，由于2D的局限性，其所占的比例已經越來越小，但是作為蛋白質組學的一個經典手段，這個專題如果能夠幫助大家在2D上節(jié)約時間，從而更好的投入進一步的功能和通路分析中去，我的初衷也就到達了。

上次的專題我們是以一*漂亮的2D膠圖開場的，這次我們就以一*"噩夢〞開場吧，o(∩_∩)o...

一、樣本制備過程

現象：氨甲?；瘷M向點系列〔見下列圖〕

原因：尿素中有雜質

解決：更換新的尿素或者通過強陽離子交換柱去除異氰酸鹽，這個現象有時候在沒有雜質的時候也有少量出現，但是不會像這種情況這么明顯，但是也表現為一個蛋白質點在水平方向上的系列拖尾，經質譜鑒定都是同一蛋白。

現象：見下列圖

原因：三氯醋酸-丙酮沉淀所得到的沉淀僅僅用冷丙酮洗了，而三氯醋酸仍然殘留在了沉淀中，從而影響了結果。

解決：使用90%的丙酮與10%的水配比來洗沉淀，三氯醋酸-丙酮沉淀是我們常常使用的一種純化蛋白的方法，簡單，有效，所以細節(jié)的注意就更為重要。

現象：見下列圖

分析：植物蛋白的粗提物雜質比擬多，有一些非蛋白雜質或者糖基化蛋白，對于2D的別離極為不利，需要我們通過一些方法來提純

現象：見下列圖a,b,c

分析：這3*圖是來自于植物蛋白提取物在不同的處理方式之下所跑出的2D圖譜，a圖是沒有經過沉淀的植物蛋白粗分直接用裂解液溶解后得到的2D圖譜〔w/o=without〕大家可以看到，由于植物蛋白中的雜質比擬多，所以背景很深，這個情況在做水稻和擬南芥等樣本的時候常常能夠遇到。b圖是經過甲醇沉淀的樣本，大家可以看出背景有一定的減弱，c圖是經過TCA-丙酮沉淀的樣本所跑出的2D，蛋白質點展現最正確，所以大家在處理樣本的時候如果是植物樣本，可以考慮沉淀一下，一般能夠到達更好的效果。

現象：見下列圖a,b

分析：這里是另外一種我們常見的純化粗蛋白的方法--2DCLEANUPKIT，我這里并不是給GE做廣告，因為確實是我自己用到的方法。其實2D-CLEANUP是一個很好的方法，但是重點在于處理完以后你的又白又漂亮的蛋白怎么辦？這個就和你的樣本中可溶性蛋白的含量多少有關了，如果你是全細胞組分，或者分泌性的含比擬多的可溶性蛋白的樣本用裂解液能夠很快溶解掉，但是如果你做得是比擬單一的成分或者雜質和疏水性成分比擬多的樣本，則在提純后，去雜質除掉一局部，然后再溶解也要喪失一大局部，自然會感覺樣本損失很大了。

怎樣改良你的樣本在2D-CLEANUPKIT處理后的溶解性呢？GE的工程師給了以下幾點建議：

1.延長裂解液溶解時間數小時(或者過夜)

2.小心的超聲波助溶(一般是5/5，防止樣本過熱，同時在水槽中加冰袋)

3.冰凍的沉淀物直接投入室溫的裂解液中有助于溶解

4.使用含SDS的強力裂解液

現象：鹽離子的干擾，見下列圖

分析：樣本是E.colie*tract，用的是pH4-7的窄范圍IPG膠條，其中左圖沒有鹽離子干擾，右圖有30mMNaCl的存在，我們一比擬就明顯的看的出，右圖的橫紋非常的明顯。這就需要我們在樣本制備過程中非常注意鹽的干擾，通過沉淀，純化等方法首先去除掉鹽，如果已經在裂解液中了，則在實驗過程中采用杯式上樣或者鹽橋都可以一定程度上減少鹽的影響。

現象：鹽離子干擾，見下列圖

分析：使用的材料是cellline,用的是IPG3-10的線性膠條，但是過程中電壓上不上去，而且結果中蛋白質點都堆積在了一起，原因是在裂解之前洗細胞的PBS平衡液沒有瀝干凈，從而帶了大量的鹽離子進入了樣本。所以我們在實驗過程中要注意吸干凈，或者采用相對來說鹽濃度低的D-HANKS緩沖液和山梨醇溶液來洗細胞。

現象：樣品透析提純的影響，見下列圖

分析：實驗用的是pH6-11的IPG膠條，左圖為未經處理的樣本，右圖是經過透析處理的樣本，可以看出無論的背景還是蛋白質點的分布都有了很好的改善。透析一般用樣品的50倍體積的buffer，48小時以上，另外，可以采取多換液加攪拌的方式加快透析速度。透析的目的主要是除鹽和有機溶劑。目前也可以采用MILLIPORE的超濾離心濃縮來提純樣本，比透析效率更高。

2D樣本處理小結

這*圖的主要目的是讓大家比擬一下樣本處理對2D實驗結果是多么的重要。以下的3*圖是來自于第3齡的果蠅幼蟲的蛋白抽提物的三種不同的處理方式所得到的2D圖譜。膠的上樣量是基于同樣數量的樣本，而不是基于同樣的蛋白量。第一向IEF使用的是pH3-10線性膠條，水化液為8Murea,2%CHAPS,0.5%IPGbuffer,65mMDTT

左圖展現的是幼蟲勻漿以后直接參加8Murea,4%CHAPS以及PMSF作為蛋白酶抑制劑來裂解。這是一個比擬標準的樣本制備過程，但是從圖上可以看出，2D的結果并不好，背景太深，蛋白質點的分布和別離的情況也不好。

中圖展現的是將幼蟲勻漿以后使用2%的SDS裂解，并且隨后在95°下加熱3分鐘處理得到的圖譜。雖然有SDS的存在，但是2D的展現很好，點別離清楚，并且在垂直的分子量水平上和水平的等電點上都得到了很好的展現。

右圖展現的是將所提取的蛋白用TCA和丙酮沉淀以后再在尿素和CHAPS中重懸，這個同樣是一個我們常常使用的技術手段。蛋白質點的分辨率很好，但是總的蛋白質量卻比擬低，這個造成的原因可能是沉淀后的蛋白沒有能夠很好的完全溶解所造成的，這個情況在2DCLEANUPKIT的使用過程中也常常出現。

二、其他2D結果的實例分析

現象：高豐度蛋白過飽和，見下列圖

分析：這個現在在銀染的過程中比擬常見，熒光染中間有時候也有，銀染的過程不是線性的比例過程，如果開場*些蛋白質結合的顯色顆粒多的話到后面就會越來越濃，從而嚴重影響膠圖的展現和結果的分析。為了解決這個問題我們必須減少上樣量或者采用考馬斯亮藍染色這種動態(tài)范圍比擬寬的染色方法。最近BIO-RAD推出的一種ProteoMiner?ProteinEnrichment技術對于解決這種高豐度蛋白過飽和現象也有一定的幫助。

現象：堿性端大量橫條紋，見下列圖

分析：2D的致命弱點之一就是對于極酸極堿的蛋白分析和展現的不利。下列圖是IPG-strippH7.5-9.5的堿性條帶,上樣量為80ug的鼠肝蛋白.聚焦到80kVh,16hours.堿性端蛋白橫紋很多是很正常的，并不是其他的原因引起的，所以我們只能盡可能的在條紋中多展現出點來，推薦使用DeStreak?或者TBP來提高堿性端蛋白的分辨率。

現象：堿性端垂直條紋

分析：使用的是pH4-7的窄范圍梯度膠條，堿性端出現明顯的垂直條紋，這是什么原因呢？其實是正常的，因為pH4-7的膠條并不是沒有7以上的局部，只是壓縮了而已，所以這個垂直條紋包括了所有的等電點高于7的蛋白質。

現象：堿性端蛋白上樣

分析：使用的是pH6-11的窄范圍膠條，如下列圖左邊是普通的上樣槽上樣，而右圖是使用了CUP-LOADING上樣的，可以明顯的看出杯式上樣對于堿性蛋白的別離有著明顯的改善，假設再結合上DESTREAK或者TBP能夠使得堿性蛋白得到更好的展現〔當然現在根本做堿性蛋白和疏水性蛋白都是用管膠或者非膠系統。〕

現象：橫條紋的產生

分析：a,b,c圖分別是蛋白質上樣過高，聚焦不充分和過度聚焦所造成的橫條紋或者拖尾。

a.蛋白質上樣量過高造成拖尾怎么辦？我們很難判斷出溶解在高濃度的尿素和去污劑中蛋白質的性質。所以用小膠做預實驗是一個不錯的選擇來確定我們的大膠的上樣量和處理方式。

b.聚焦不充分的現象有以下幾個:

-橫條紋主要存在于高分子量區(qū)域〔解決方法是延長聚焦時間〕

-橫條紋在膠上到處都是(大量延長IEF時間，而不僅僅是聚焦)

c.過度聚焦的現象有

-橫條紋主要存在于靠近電極的地方(電內滲現象的干擾)

-橫條紋存在于*些蛋白的一側(蛋白質降解的原因)(解決方法是縮短聚焦時間)

現象：大量橫條紋分析：聚焦不夠同時鹽離子濃度過高。

現象：見下列圖

分析：在IPG過程中IPGSTRIP的瓷條析出了冷凝水造成的后果，所以在準備的時候要注意先把瓷條自然風干或者烘干。

現象：平衡時間對于結果的影響

分析：在IEF完成之后在向2向的轉移過程中平衡非常重要，有時候可能覺得耽誤點時間沒關系，但是一次2條還好，如果是6條的話，可能就會不自覺的延長了平衡時間了，下列圖就是不同平衡時間對2D結果的影響，所以大家一定要嚴格控制好時間，不然會對結果造成嚴重影響。左圖是標準時間內完成的，右圖是延長了復原5分鐘，延長了烷基化15分鐘之后的后果。

我們還要注意的是1.不烷基化會怎么樣？會在2向上造成大量垂直拖尾

2.在參加烷基化平衡液之前一定要瀝干DTT平衡液，不然會大為減低效力

現象：化學藥品質量問題的影響

分析：TEMED過期了的后果;促進膠凝結的過硫酸銨和TEMED我們平時一定要注意，特別是過硫酸銨一定要新配的比擬好。

現象：化學藥品質量問題的影響

分析：Tris有質量問題

現象：蛋白質點的喪失

分析：2向蛋白質轉移中SDS過程中電壓過高〔18cm的到達或者超過400V〕，如果是ETTAN6系列的話，不要在最初的45分鐘內超過2W/GEL。SDS到底是恒流好還是恒壓還是恒功率好？其實都可以，不過要看樣品特點和膠的濃度而定，恒流電壓會慢慢增大恒20mA15%的膠到最后估計要有200V以上了，高分子區(qū)帶好，低分子區(qū)太快，就會比擬難看恒壓建議分2段，過堆積膠前較低，進別離膠再調高，這樣樣品在分界限上能被壓得很細。

現象：*些蛋白質產生一些垂直條紋分析：樣本為鼠肝樣本，造成垂直條紋的原因是由于平衡過程中中的第一步復原的DTT量缺乏造成的。

象：銀染過程中形成的過飽和點

分析：和上樣量和染色時間有關，比擬難以控制，除非改變染色方法，因為目前銀染一般是用來做*圖譜，來看看到底能別離到多少個點。過飽和點對于圖像分析和質譜鑒定都會有比擬大的影響。

現象：在膠的下部有一大片黑色的區(qū)域

分析：IPGbuffers/SDS形成的復合物被污染了，因為