酶和細(xì)胞固定化詳解演示文稿

酶和細(xì)胞固定化詳解演示文稿當(dāng)前1頁，總共42頁。優(yōu)選酶和細(xì)胞固定化當(dāng)前2頁，總共42頁。1、固定化酶的定義2、酶的固定化方法3、固定化酶的特點(diǎn)GoGoGo4、固定化酶的評價Go當(dāng)前3頁，總共42頁。7.1固定化酶的定義水溶性酶水不溶性載體固相酶（水不溶性酶）固定化技術(shù)當(dāng)前4頁，總共42頁。

固定化酶(enzymeimmobilization):是指固定在一定的載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。形式：酶柱—連續(xù)生產(chǎn)反應(yīng)器—批式攪拌反應(yīng)酶膜、酶管—分析化學(xué)微膠囊酶—治療酶

當(dāng)前5頁，總共42頁。幾點(diǎn)要求:

（酶的固定化）

保持酶的催化活性和專一性固定化酶可回收及多次使用酶固定化后產(chǎn)生的位阻要小固定化酶的成本盡可能低，以利用于工業(yè)化生產(chǎn)使用當(dāng)前6頁，總共42頁。7.2酶固定化方法當(dāng)前7頁，總共42頁。通過氫鍵、疏水作用、離子鍵等物理作用，將酶或含酶菌體吸附在水不溶載體表面的方法。是酶固定化最簡單的方法

1、吸附法(absorptionmethod)當(dāng)前8頁，總共42頁。（1）物理吸附法酶與載體之間的親和力：范德華力、氫鍵、疏水作用常用的載體：有機(jī)載體和無機(jī)載體

有機(jī)載體：纖維素、淀粉、骨膠原、火棉膠無機(jī)載體：氧化鋁、硅藻土、微孔玻璃無機(jī)載體吸附容量低，一般在每克載體吸附1mg蛋白。有機(jī)載體吸附容量高一些，火棉膠吸附木瓜蛋白，吸附容量每平方厘米膜70mg蛋白。當(dāng)前9頁，總共42頁。特點(diǎn)：載體來源廣泛、操作簡單、對酶的活性中心和高級結(jié)構(gòu)影響少

。由于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制當(dāng)前10頁，總共42頁。（2）離子吸附法酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶載體的固定方法。常用的載體

陰離子交換劑：二乙基氨基乙基（DEAE）—纖維素、

DEAE—葡聚糖凝膠陽離子交換劑：CM-纖維素、纖維素檸檬酸鹽離子吸附容量一般大于物理吸附容量，50-150mg蛋白/g載體當(dāng)前11頁，總共42頁。將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法多孔載體：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、明膠

2、包埋法(entrapmentmethod)當(dāng)前12頁，總共42頁。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單，酶分子僅僅被包裹，未受到化學(xué)反應(yīng)，酶活力回收力高。缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物的酶，不適合作用于大分子底物的酶根據(jù)載體材料和方法不同分為：凝膠包埋法半透膜包埋法當(dāng)前13頁，總共42頁。將酶或含酶菌體包埋交聯(lián)的水不溶凝膠格子的包埋方法。常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂等合成凝膠。

1）凝膠包埋法當(dāng)前14頁，總共42頁。海藻酸鈣凝膠包埋法將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。操作簡單、條件溫和，對細(xì)胞無毒。當(dāng)前15頁，總共42頁?！駥⒚赴裼诰哂邪胪感跃酆衔锬?nèi)的固定化方法。

半透膜的孔徑小于酶分子的直徑，可以防止酶與膜外環(huán)境直接接觸，增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性?！癯Ｓ糜谥苽涔潭ɑ傅陌胪改び芯埘０纺?、火棉膠膜等。

2）半透膜包埋法當(dāng)前16頁，總共42頁。酶分子與載體之間以共價鍵作用而實(shí)現(xiàn)結(jié)合的固定方法稱為共價鍵結(jié)合法。共價鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。3、共價結(jié)合法(combinemethod)當(dāng)前17頁，總共42頁。載體的要求選擇親水性載體載體結(jié)構(gòu)松散、表面積大、一定的機(jī)械強(qiáng)度載體要有在溫和條件下與酶共價結(jié)合的功能基團(tuán)載體沒有或少有非專一性吸附載體來源容易、可反復(fù)使用當(dāng)前18頁，總共42頁。載體的選擇

載體結(jié)構(gòu)疏松、表面積大、機(jī)械強(qiáng)度載體有與酶共價的功能基團(tuán)載體吸附功能有一定的專一性載體來源廣、價格廉價、重復(fù)使用當(dāng)前19頁，總共42頁。酶蛋白上可供載體結(jié)合的基團(tuán)酶蛋白N端氨基或賴氨酸的ε-氨基酶蛋白C端的羧基以及天冬氨酸和谷氨酸的r-羧基半胱氨酸的巰基絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸-羥基組氨酸-咪唑基苯丙氨酸、酪氨酸—苯環(huán)色氨酸的吲跺基r當(dāng)前20頁，總共42頁。酶分子可以形成的共價鍵基團(tuán)氨基、羧基、巰基、咪唑基常用的載體活化與偶聯(lián)反應(yīng)：重氮反應(yīng)、疊氮反應(yīng)、溴化氮法、烷化法當(dāng)前21頁，總共42頁。當(dāng)前22頁，總共42頁。借助雙功能試劑在酶分子之間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間發(fā)生交聯(lián)作用，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。4、交聯(lián)法(crosslinkingmethod)當(dāng)前23頁，總共42頁。常用的雙功能試劑戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐其中常用的是戊二醛交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固，但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長補(bǔ)短。當(dāng)前24頁，總共42頁。共價交聯(lián)法的四種形式：（1）酶直接交聯(lián)法（2）酶輔助蛋白交聯(lián)（4）載體交聯(lián)法（3）吸附交聯(lián)法當(dāng)前25頁，總共42頁。借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。

固定化依賴于酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時間之間的平衡。操作簡單，但是缺乏選擇性，固定化的重現(xiàn)性較差，活力回收往往不高。（1）酶直接交聯(lián)法：當(dāng)前26頁，總共42頁。舉例：酶直接交聯(lián)法—固定化酶木瓜蛋白酶0.2℅酶蛋白濃度、2.3℅戊二醛、pH5.2~7.2、0℃交聯(lián)24小時，可形成固定化酶。隨pH升高，固定化速度增加pH低于4不能形成固定化酶有人認(rèn)為pH控制在酶的等電點(diǎn)附近有利于固定化當(dāng)前27頁，總共42頁。

酶分子在雙功能試劑或多功能試劑的作用下，與一些惰性蛋白或水不溶的載體之間發(fā)生交聯(lián)的酶固定法。當(dāng)可得到的酶量有限，可以使用第二個“載體”蛋白來增加蛋白質(zhì)濃度，可使酶與惰性蛋白共交聯(lián)。常用的載體蛋白：牛血清白蛋白、卵清蛋白、明膠、血紅蛋白等。舉例：利用卵清固定化木瓜蛋白酶

（2）酶輔助蛋白交聯(lián)：當(dāng)前28頁，總共42頁。此法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。（3）吸附交聯(lián)法：當(dāng)前29頁，總共42頁。用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團(tuán)偶聯(lián)酶蛋白。

（4）載體交聯(lián)法：當(dāng)前30頁，總共42頁。5、四種固定化酶制備方法的特點(diǎn)小結(jié)物理吸附包埋法共價結(jié)合法共價交聯(lián)法制備易易難難結(jié)合力弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活力高高中中底物專一性無變化無變化有變化有變化再生可能不可能不可能不可能固定化費(fèi)用低中高中制法特性當(dāng)前31頁，總共42頁。7.2固定化酶的特性：固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。固定化酶的最適溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。酶經(jīng)過固定化后，其作用的最適pH值往往會發(fā)生一些變化。固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。

當(dāng)前32頁，總共42頁。（一）影響固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的因素

酶經(jīng)過固定化后引起的性質(zhì)改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學(xué)性質(zhì)的影響。就載體物化性質(zhì)和固定化過程影響而言，主要存在以下三種影響效應(yīng)：

分配效應(yīng)

空間障礙效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng)當(dāng)前33頁，總共42頁。由于載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，而將主體溶液稱為宏觀環(huán)境。由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個環(huán)境之間的不同分配，被稱為分配效應(yīng)。

1、分配效應(yīng)當(dāng)前34頁，總共42頁。固定化之后，由于酶的空間自由度受到限制(因?yàn)檩d體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成了空間屏障)，使酶分子的活性基團(tuán)不易與底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的活性中心對底物的定位作用,所造成的對固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱為空間障礙效應(yīng)。

2、空間障礙效應(yīng)當(dāng)前35頁，總共42頁。當(dāng)前36頁，總共42頁。

酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了擴(kuò)散阻力：

1）、外擴(kuò)散阻力是底物從宏觀環(huán)境向酶顆粒表面?zhèn)鬟f過程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反應(yīng)之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。

2）、內(nèi)擴(kuò)散阻力是指底物分子達(dá)到固相酶表面后傳遞到酶活性部位時的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時進(jìn)行。載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內(nèi)擴(kuò)散阻力。

3、擴(kuò)散限制效應(yīng)當(dāng)前37頁，總共42頁。7.3固定化酶的評價1、固定化酶的活力測定間歇測定連