分子生物學(xué)試驗室常用儀器設(shè)備簡介

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一、試驗?zāi)康?/p>

熟悉分子生物學(xué)試驗室常用儀器并熟練使用二、試驗原理

1、恒溫氣浴搖床：用于對溫度和振蕩頻率有較高要求的細菌培養(yǎng)，發(fā)酵，雜交，生化反應(yīng)及酶和組織研究等。

2、超凈工作臺：用于分子生物學(xué)無菌操作。

3、低溫臺式高速離心機：用于分開純化DNA和蛋白質(zhì)等，如基因片段的分開，蛋白酶的沉淀和回收等。

4、微量移液管：是連續(xù)可調(diào)的，計量和轉(zhuǎn)移液體的專用儀器，其裝有直接讀數(shù)容量計。有多種規(guī)格：①0.5-10μL②10-100μL③20-200μL④100-1000μL。

5、電泳儀：用于確定大分子物質(zhì)的分子量以及鑒定物種親緣關(guān)系的儀器。

6、PCR儀：用于目的基因的擴增，是一對寡糖核苷酸引物結(jié)合到正負DNA鏈上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列DNA片段。主要用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等領(lǐng)域。

7、滅菌鍋：用于細菌和細胞培養(yǎng)及核酸等有關(guān)試驗使用的試劑，器皿及試驗用具的嚴格滅菌。

三、試驗儀器

恒溫氣浴搖床、超凈工作臺、低溫臺式高速離心機、微量移液管、滅菌鍋、PCR儀、電泳儀。

四、試驗步驟

（一）、恒溫氣浴要穿的使用：1、樣品瓶穩(wěn)固放入彈簧夾中

2、接通電源開關(guān)，儀器進入準備狀態(tài)3、參數(shù)設(shè)定，（設(shè)定溫度、時間、轉(zhuǎn)速等參數(shù)）

4、按啟動鍵儀器開始工作，按暫停鍵可暫停托盤的旋轉(zhuǎn)；5、按電源鍵，顯示屏顯示消失，關(guān)閉電源總開關(guān)（二）、超凈工作臺的使用

1、使用工作臺時，先經(jīng)過清潔液浸泡的紗布擦拭臺面，然后用消毒劑擦拭消毒。2、接通電源，提前30分鐘開啟紫外燈照射消毒，處理凈化工作區(qū)內(nèi)工作臺表面積

累的微生物，15分鐘后，關(guān)閉紫外燈，開啟送風(fēng)機。

3、工作臺面上，不要存放不必要的物品，以保持工作區(qū)內(nèi)的清白氣流不受干擾。4、操作終止后，清理工作臺面，收集各廢棄物，關(guān)閉風(fēng)機及照明開關(guān)，用清潔劑及消毒劑擦拭消毒。

5、最終開啟工作臺紫外燈，照射消毒30分鐘后，關(guān)閉紫外燈，切斷電源。（三）、低溫臺式高速離心機的使用

1、把離心機放置于平面桌或平面臺上，目測使之平衡，用手輕搖一下離心機，檢查離心機是否放置平衡。

2、開啟門蓋，將離心管放入轉(zhuǎn)子內(nèi)，離心管必需成偶數(shù)對稱放入，且要事先平衡，完畢用手輕輕旋轉(zhuǎn)一下轉(zhuǎn)子體，使離心管架運轉(zhuǎn)靈活。

3、關(guān)上門蓋，注意一定要使門蓋鎖緊，完畢用手檢查門蓋是否關(guān)緊。

4、插上電源插座，按下電源開關(guān)（電源開關(guān)在離心機后面，電源座上方）。5、設(shè)置轉(zhuǎn)子號、轉(zhuǎn)速、時間：

在中止?fàn)顟B(tài)下時，用戶可以設(shè)置轉(zhuǎn)子號、轉(zhuǎn)速、時間，此時離心機處于設(shè)置狀態(tài)，中止燈亮、運行燈閃爍；按下啟動離心開始

（常用，最高轉(zhuǎn)速為13000r/min，時間最長為20分鐘）；

注意：對應(yīng)的轉(zhuǎn)子一定要設(shè)置在相應(yīng)的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，不可超速使用，否則對試管或轉(zhuǎn)子有損壞。

6、離心機時間倒計時到“0〞時，離心機將自動中止，當(dāng)轉(zhuǎn)子停轉(zhuǎn)后，開啟門蓋取出離心管，關(guān)斷電源開關(guān)。

（四）、微量移液管的使用

1．將微量移液器裝上吸頭（不同規(guī)格的移液器用不同的吸頭）2．將微量移液器按鈕輕輕壓至第一停點；

3．垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液樣面下幾毫米，千萬不要將吸嘴直接插到液體底部；

4．緩慢、平穩(wěn)地松開控制按鈕，吸上樣液。否則液體進入吸嘴太快，導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部，或吸入體積減少；5．等一秒鐘后將吸嘴提離液面

6．平穩(wěn)地把按鈕壓到第一停點，再把按鈕壓至其次停點以排出剩余液體；7．提起微量移液器，然后按吸嘴彈射器除去吸嘴。

（五）、PCR的使用

1、開機：開啟開關(guān)，視窗上顯示“SELFTEST〞。2、放入樣品管，關(guān)緊蓋子。

3、假使要運行已經(jīng)編好的程序，則直接按《Proceed》，用箭頭鍵選擇已儲存的程序，按《Proceed》，則開始執(zhí)行程序。

4、假使要輸入新的程序，則在RUN-ENTER菜單上用箭頭鍵選擇ENTERPROGRAM,按《Proceed》，

1）命名新的程序，最多8個字母，輸入后按《Proceed》確認(如何輸入字母、數(shù)字)。2）輸入程序步驟：名字輸入后，確認，然后輸入相關(guān)程序

5、輸入完成的程序后，到RUN-ENTER菜單，選擇新程序，開始運行。6、其它：用《pause》可以暫停一個運行的程序，再按一次繼續(xù)程序。用《stop》或《Cancel》可中止運行的程序。

（六）、電泳儀的使用

1．首先用導(dǎo)線將電泳槽的兩個電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。2．按電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀?〞等字樣后，同時系統(tǒng)初始化，蜂鳴4聲，設(shè)置常設(shè)置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。3．確認各參數(shù)無誤后，按“啟動〞鍵，啟動電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start!并蜂鳴4聲，提醒操電泳儀將輸出高電壓，注意安全。之后逐漸將輸出電壓加至設(shè)置值。同時在狀態(tài)欄中顯示“Run〞，并有兩個不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實際的工作時間（確切到秒）

4．電泳終止，儀器顯示：“END〞，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時按任一鍵可止鳴

（七）、高壓滅菌鍋

1、開蓋：轉(zhuǎn)動手輪，使鍋蓋離開密封圈，添加蒸餾水剛沒至板上

2、通電：將控制面板上電源開關(guān)按至ON處，若水位低（LOW）紅燈亮

3、堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過200mm×100mm×100mm為宜，各包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果，滅菌時間：121℃，20min，；如為液體，液體必需裝在可耐高溫的玻璃器皿中，且不可裝滿，2/3即可，121℃，18-20min

4、密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊5、設(shè)定時間和溫度，開始滅菌

6、滅菌終止，所有東西放入枯燥箱枯燥，排盡水氣五、思考題

1、列出分子生物學(xué)常用儀器的名稱，用途及操作時的本卷須知。

答：①恒溫氣浴搖床：常用于液體搖勻以培養(yǎng)微生物、細菌和細胞等。注意要依據(jù)不同的用途設(shè)置不同的參數(shù)。②超凈工作臺：常用于為微生物學(xué)試驗提供無菌操作環(huán)境。注意操作時關(guān)掉紫外燈，避免給人類帶來傷害。③低溫臺式高速離心機：常用于分開純化蛋白、病毒、細胞等。使用時不能隨便移動離心機或開啟蓋子；離心機運行時要處于鎖定狀態(tài)；離心管的放置要處于平衡狀態(tài)。④微量移液管：用于計量和轉(zhuǎn)移微量液體的專用儀器。操作時注意避免槍頭的污染；調(diào)理刻度時不宜超過最大量程；使用完后將刻度調(diào)到最大珍藏。⑤電泳儀：可對不同物質(zhì)進行定性或定量分析，或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M行組分分析或單個組分的提取制備。操作時不可把導(dǎo)線極性接反；當(dāng)電泳儀進入工作狀態(tài)后，避免人體與其各部分的接觸，不同介質(zhì)支持物的電泳不要同時在同一電泳儀上進行；若使用時出現(xiàn)異常，要立刻切斷電源。⑥PCR儀：用于擴增DNA片斷。操作時應(yīng)注意蓋子要蓋緊，按正確步驟進行。⑦高壓高溫滅菌鍋：用于殺菌消毒。使用時應(yīng)嚴格依照規(guī)程操作，避免發(fā)生安全事故。

試驗二瓊脂糖凝膠電泳的制備及核酸檢測

一.試驗?zāi)康?/p>

1、把握瓊脂糖凝膠電泳的原理;2、學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。二.試驗原理

瓊脂糖是一種自然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。

DNA分子在堿性環(huán)境中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分開DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠（EB）未扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強度大10倍以上，且熒光強度與DNA含量成正比。三、儀器和試劑

儀器：微量移液器，電泳儀，電泳槽，微波爐

試劑：瓊脂糖：1.0%；電泳緩沖液（50×TAE電泳緩沖液取Tris24.2g，冰醋酸

5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸餾水至100ml）EB：5μl/100mlTBE

電泳材料：標(biāo)準分子量核酸（DL2000）四.操作步驟

（1）制膠（以20mL為例）

a.稱取0.2g瓊脂糖，參與20ml的1XTAE緩沖液（pH8.0），搖勻；b.微波爐加熱，至瓊脂糖完全溶解（要防止過熱溢出三角瓶）；

c.將制膠板放入制膠槽中，插入適當(dāng)?shù)氖嶙樱瑢⑷芙獾沫傊牵s50℃）參與2ulEB后，混均勻，倒入其中，直至厚度為4～6mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固(約30~45min)；

d.防備垂直向上拔出梳子,以保證點樣孔完好,將膠板置于電泳槽中。（2）點樣

用微量移液器將5μl含藍色染液的DL2000參與點樣孔下部。（3）電泳

開啟電源開關(guān)，調(diào)理電壓至3~5V/cm(約100V)，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，約30-40分鐘后即可觀測結(jié)果。（4）觀測

將電泳好的膠置于紫外透射檢測儀上，開啟紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細，可粗略估計該樣品DNA的濃度。宛如時有已知分子量的標(biāo)準DNA進行電泳，則可通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。五、試驗結(jié)果

點樣時效果較好的照片點出的白色熒光線比較亮，條帶粗細