基因工程使用CRISPR

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目標核酸酶是強大的工具對于高精度調理基因組。來自微生物適應性免疫系統(tǒng)(crispr)的指導RNAcas9核酸酶可以被用來促進高效的真核細胞基因組工程，通過在其指導rna內指定一個20-nt目標序列。在這里,我們

描述一組用來基因組編輯工具cas9-mediated，通過(NHEJ)或(HDR)在哺乳動物細胞中,以及下游功能研究代轉基因細胞系。為了減少非目標分裂,我們進一步描述double-nicking策略使用用配對的指導rna的cas9nickase突變。這個協議提供了試驗結果為指導的目標選擇,分裂效率的評價和分析非目標活動。目標設計、基因修改可以在短短1-2周實現,修改克隆細胞株2-3周內可生成。

introduction

控制生物系統(tǒng)能力,在基礎科學生物、藥學和生物技術擁有巨大的應用潛力?？删幊叹唧w序列核酸酶、促進內源性基因位點的確切編輯現在可以實現系統(tǒng)基因組功能的訊問和在廣泛的物種基因變異,包括那些以前沒有基因易處理的。最近幾年出現了大量的基因組編輯技術,包括(ZFNs),(Talens)和crispr。前兩種技術使用了限制核酸內切酶催化域來模塊化DNA結合蛋白質的策略包括誘導DNA雙鏈斷裂(DSB)。相比之下,Cas9是小rna引導下的核酸酶,通過與沃森克里克目標DNA堿基配對,代表系統(tǒng)明顯更簡單設計,十分具體、高效、很好的高產適應度和對于多種類型的細胞和生物體有多路復用基因編輯。

使用工程核酸酶的基因組確切編輯

和ZFNs和talens很像,Cas9通過刺激在目標基因位點DSB促進基因組編輯。尋常根據Cas9分裂,目標位點進行DNA損傷修復的兩個主要途徑之一(圖2):簡單出錯NHEJ或高保真HDR途徑,兩者都可以用來實現所需的編輯結果。缺乏修復模板狀況下，DSB通過NHEJ重新捆綁,使缺口發(fā)生插入/刪除(indel)的突變。NHEJ可以被用來調理基因淘汰,indels發(fā)生在編碼外顯子會導致移碼突變和過早地中止密碼子。多個DSB另外可以用來調解更大的基因組中刪除。

HDR是另一個主要的DNA修復途徑。盡管HDR尋常發(fā)生在比NHEJ更低,頻率更多樣的狀況下，它可用于在外在的引入修復模板存在的狀況下在目標位點生成確切明確修改。修復模板的形式可以是使用同源臂側面插入序列的傳統(tǒng)雙鏈DNA目標結構,或單鏈DNA寡核苷酸(ssODNs)。后者提供了一種有效而簡單的方法使我輯基因組中,如摸索隨機的基因變異的單核苷酸突變。與NHEJ不一樣,HDR尋常只在細胞分裂活躍,和它的效率區(qū)別很大取決于細胞類型和狀態(tài),以及基因位點和修復模板。

Cas9:對于基因組編輯的RNA引導核苷酸

Crispr-cas是用RNA引導核苷酸來分開外來基因元素的微生物適應性免疫系統(tǒng)。三種類型(1-3)CRISPR系統(tǒng)已經被確認在廣泛的宿主細菌和古細菌存在,其中每個系統(tǒng)由一群CRISPR-associated(Cas)基因,非編碼rna和一系列獨特的重復元素(直接重復)。這些重復被隔開通過短的多樣的來自外源DNA序列目標（稱為protospacers）,和他們一起構成了CRISPRRNA(crRNA)排列。在DNA目標內,每個protospacer總是與protospaceradjacentmotif(PAM)相連，可多樣化依靠于特定的CRISPR系統(tǒng)。II型CRISPR系統(tǒng)是一個最好的特點的、,由核酸酶Cas9,crRNA排列編碼指導rna和必需的、輔助的、促進crRNA排列變成離散單元的進程的trans-activatingcrRNA(tracrRNA)。然后每個crRNA單元包含一個20-nt指導序列和部分直接重復,前者指導Cas9變成20-bpDNA目標通過沃森克里克配對(圖1)。在來自釀膿鏈球菌和CRISPR-Cassystem中，(該協議中使

用的系統(tǒng)),目標DNA必需馬上先于5-NGGPAM，

圖1|示意圖的RNA-guided

Cas9核酸酶。從化膿性鏈球菌(黃色)來的Cas9核酸酶是針對基因組DNA(例如人類EMX1位點)通過一個20-nt引導序列(藍色)和支架(紅色)組成的sgRNA。引導序列(藍色欄上鏈)在直接上游的必需的5-NGG(PAM,粉色)與DNA目標配對。Cas9在上游的PAM(紅色三角形)。協調DSB~3bp。

而其他Cas9直接同源可能有不同的PAM需求,如S.thermophilus(5-NNAGAAforCRISPR1和5-NGGNGforCRISPR3)和腦膜炎雙球菌(5-NNNNGATT)。

CRISPR-Cas的RNA引導的核酸酶的作用是通過不同表達人類最優(yōu)密碼子的Cas9和必要的RNA來組成重組在哺乳動物細胞上。此外,crRNA和tracrRNA融合在一起來創(chuàng)立一個嵌合,單引導的RNA(sgRNA)(圖1)。Cas9因此可以通過改變sgRNA在內的20-nt引導序列在最接近的PAM序列上重新定向到幾乎所有的興趣目標。

由于其易于實現和多路復用能力,Cas9一直用于通過NHEJ和HDR生成帶著特定突變工程真核細胞型。直接注入sgRNA和信使rna編碼Cas9成胚胎在多個等位基因修改上使轉基因小鼠快速傳代。這些結果編輯生物的巨大前景,否則基因難辦。

Cas9核酸酶利用保守的ＨＮＨ和RuvC核酸酶域進行特定斷裂分裂,這可以突變和利用額外的功能。aspartate-to-alanine(D10A)突變在RuvC催化域下允許Cas9切口酶突變(Cas9n)而不是分裂DNA單鏈斷裂,后續(xù)優(yōu)先修理通過HDR可以潛在地從off-target的ＤＳＢs減少不必要的indel突變的頻率。適當的補償sgRNA可以指導Cas9n同時刻痕于目標位點來調理DSB,從而有效地增加目標識別的特異性。此外,Cas9突變與DNA-cleaving催化殘基突變已經適應了在大腸桿菌啟用轉錄調控,證明構建Cas9的潛力對于不同的應用程序,如熒光蛋白標簽的補償或染色質——修改特定基因位點酶報告或調理基因功能。

這里我們詳細解釋如何使用人類的密碼子優(yōu)化、細胞核定位側面的序列野生型(WT)Cas9核酸酶或突變Cas9切口酶促進真核基因編輯。我們描述設計20-nt引導序列的原因,和快速建設和功能驗證sgRNAs協議，最終使用Cas9核酸酶來調解NHEJ-based和HDR-based基因組修改(HEK293英尺)和人類干細胞(HUES9)線(圖3)。Cas9系統(tǒng)同樣可以應用到其他類型的細胞和生物體,包括人類,小鼠、斑馬魚、果蠅和線蟲。比較與其他基因組編輯技術

像其他核酸酶技術,如ZFNs和talents,Cas9可以促進目標DNADSB針對哺乳動物基因組特定

位點（interest）,刺激基因組編輯通過NHEJ或HDR。Cas9通過ZFNSandTALENs提供了幾種潛在的優(yōu)勢和取得,包括定制的緩解,更高的目標效率和促進多元基因組編輯的能力。由于自定義ZFNs尋常很難設計,我們將主要比較Cas9和TALEN。\\易于定制。\\分裂模式。

圖2|DSB修復促進基因編輯。Cas9(黃色)引起的DSB可以以兩種方式中的一種修復。簡單出錯NHEJ通路,結尾的DSB被內源性DNA修復機械處理過和被重新參與,這會導致接口處隨機indel突變。Indel突變發(fā)生在一個基因的編碼區(qū)可能導致轉移（堿基的）和創(chuàng)立一個過早終止密碼子,導致基因敲除。另外,質粒形式的修復模板或ssODN可以利用HDR通路,使得高保真和確切的編輯。單鏈DNA也能導致HDR缺口。

圖3|時間軸和試驗的概述。對試劑的步驟設計、施行、驗證和細胞系擴張進行描述。為每個目標自定義的sgRNAs(淺藍色),以及pcr引物,在電腦中通過CRISPR設計工具設計(網站)。sgRNA引導序列克隆到表達質粒軸承sgRNA腳手架骨干(BB)和Cas9pSpCas9(BB)。由此產生的質粒被標注為pSpCas9(sgRNA)。完成并序列證明的pSpCas9(sgRNA)質粒和可選為促進HDR的修復模被轉染到細胞和測驗它們的調解有針對性的分裂的能力。最終,轉染細胞可以無性繁殖系地擴大以在特定突變下推導出同基因

的細胞系。

編輯效率。SpCas9和TALENS對于多種細胞類型和生物有促進基因組編輯的效率。然而,由于目標的難易程度,CAS9同時可用于針對多個基因位點，通過合傳遞sgRNAs的組合到細胞行列中。