電子傳遞與氧化磷酸化

電子傳遞與氧化磷酸化第1頁/共155頁Cellsneedenergytodoalltheirwork

Togenerateandmaintainitshighlyorderedstructure(biosynthesisofmacromolecules).Togenerateallkindsofmovement.Togenerateconcentrationandelectricalgradientsacrosscellmembranes.Tomaintainabodytemperature.Togeneratelightinsomeanimals.第2頁/共155頁第3頁/共155頁Somehistoricalfactsaboutourunderstandingonoxidativephosphorylation

1930s:PyruvatewasknowntobecompletelyoxidizedtoCO2viathecitricacidcycle(withO2consumed).1930s:NAD+andFADwerefoundtobee-carriersbetweenmetabolitesandtherespiratorychain.1930s:RoleofATP

andgeneralimportanceofphosphorylation

inbioenergeticswererealized.第4頁/共155頁

1950s:Isolated

mitochondriawerefoundtoeffecttheobligatorycouplingofthephosphorylationofADPandthee-transferfromNADHtoO2.1961,thechemiosmotichypothesiswasproposedforlinkingthee-transferandADPphosphorylation(basedontheuncouplingphenomenon

andtheintactnessrequirement)1960s,ATPsynthasewasidentifiedfrommitochondria.第5頁/共155頁

概念：糖類、脂肪、蛋白質等有機物質在細胞中進行氧化分解生成CO2和H2O并釋放出能量的過程稱為生物氧化（biologicaloxidation），其實質是需氧細胞在呼吸代謝過程中所進行的一系列氧化還原反應過程，所以又稱為細胞氧化或細胞呼吸。生物氧化第6頁/共155頁

ConceptofBiologicalOxidation

Oxidationofmaterialsinthebiologicalbody

Degradationofglucoses,fattyacids,proteins

Releaseofenergy

FormationofCO2andH2O

TraptheenergyreleasedasATPandBodyheat

第7頁/共155頁與非生物氧化相比:相同點生物氧化與非生物氧化的比較

化學本質相同，都是失電子反應，如脫氫、加氧、傳出電子。失電子者為還原劑，是電子供體，得電子者為氧化劑，是電子受體。在生物體內，生物氧化有三種方式：加氧氧化，電子轉移和脫氫氧化。同種物質不論以何種方式氧化，所釋放的能量相同。

第8頁/共155頁Electrontransferviared-oxreactionsgeneratesbiologicalenergyOxidativereaction

De-electron

Dehydrate

AddoxygenReductivereaction

Acceptelectron

Addhydrate

De-oxygen第9頁/共155頁不同點：

生物氧化是酶促反應，反應條件（如溫度、pH）溫和；而體外燃燒則是劇烈的游離基反應，要求在高溫、高壓以及干燥的條件下進行。生物氧化分階段逐步緩慢地氧化，能量也逐步釋放；而體外燃燒能量是爆發(fā)式釋放出來的。生物氧化釋放的能量有相當多的轉換成ATP中活躍的化學能，用于各種生命活動；體外燃燒產(chǎn)生的能量則轉換為光和熱，散失在環(huán)境中。第10頁/共155頁CO2的生成

方式：生物氧化過程中生成的CO2并不是代謝物上的碳原子與吸入的氧直接化合的結果，而是有機酸脫羧作用生成的。糖、脂、蛋白質等有機物轉變成含羧基的中間化合物，然后在酶催化下脫羧而生成CO2。

根據(jù)所脫羧基在有機酸分子中的位置，可將脫羧反應分為α－脫羧和β－脫羧；又根據(jù)反應的同時是否伴有氧化反應，分為單純脫羧和氧化脫羧。

類型：α-脫羧和β-脫羧（從脫羧的位置）氧化脫羧和單純脫羧（脫羧方式）第11頁/共155頁DirectDecarboxylationa-direct

decarboxylationH3CCCOOHOa-酮酸脫羧酶Mg2+

TPPH3CCOH+

CO2第12頁/共155頁

OxidativeDecarboxylation第13頁/共155頁H2O的生成

代謝物在脫氫酶催化下脫下的氫由相應的氫載體（NAD+、NADP+、FAD、FMN等）所接受，再通過一系列遞氫體或遞電子體傳遞給氧而生成H2O

。CH3CH2OHCH3CHONAD+

NADH+H+乙醇脫氫酶1\2O2NAD+電子傳遞鏈

H2O2eO=2H+第14頁/共155頁脂肪葡萄糖、其它單糖三羧酸循環(huán)電子傳遞（氧化）蛋白質脂肪酸、甘油多糖氨基酸乙酰CoAe-磷酸化+Pi

小分子化合物分解成共同的中間產(chǎn)物（如丙酮酸、乙酰CoA等）

共同中間產(chǎn)物進入三羧酸循環(huán),氧化脫下的氫由電子傳遞鏈傳遞生成H2O，釋放出大量能量，其中一部分通過磷酸化儲存在ATP中。大分子降解成基本結構單位生物氧化的三個階段第15頁/共155頁Biologicaloxidationsarecatalyzedbyintracellularenzymes.Thepurposeofoxidationistoobtainenergy.ElectronTransport:Electronscarriedbyreducedcoenzymes(NADHorFADH2)arepassedsequentiallythroughachainofproteinsandcoenzymes(socalledelectrontransportchain)toO2.OxidativePhosphorylation:Couplinge-Transport(Oxidation)andATPsynthesis(Phosphorylation).

Itallhappensinmitochondrionorattheinnermitochondrialmembrane(eukaryoticcells)第16頁/共155頁ImpermeabletoionsandmostothercompoundsIninnermembraneknobsthemitochondrioncontainedtheenzymesresponsibleforelectrontransportandoxidativephosphorylation第17頁/共155頁MitochondriaoutermembranerelativelypermeableinnermembranepermeableonlytothosethingswithspecifictransportersImpermeabletoNADHandFADH2PermeabletopyruvateCompartmentalizationKreb'sandβ-oxidationinmatrixGlycolysisincytosol第18頁/共155頁MostenergyfromRedoxelectronsduringmetabolicreactionssenttoNADandFADGlycolysisIncytosolproduces2NADHPyruvatedehydrogenasereactionInmitochondrialmatrix2NADH/glucoseKrebsInmitochondrialmatrix6NADHand2FADH2/glucose第19頁/共155頁線粒體是生物氧化的發(fā)生場所第20頁/共155頁

線粒體基質是呼吸底物氧化的場所，底物在這里氧化所產(chǎn)生的NADH和FADH2將質子和電子轉移到內膜的載體上，經(jīng)過一系列氫載體和電子載體的傳遞，最后傳遞給O2生成H2O。這種由載體組成的電子傳遞系統(tǒng)稱電子傳遞鏈（eclctrontransferchain),因為其功能和呼吸作用直接相關，亦稱為呼吸鏈。檸檬酸循環(huán)在線粒體基質中進行，電子傳遞和氧化磷酸化在線粒體內膜上進行。電子傳遞鏈的概念第21頁/共155頁ElectronTransportandOxidativePhosphorylationElectrontransportandoxidativephosphorylationre-oxidizeNADHandFADH2andtraptheenergyreleasedasATP.Ineukaryotes,electrontransportandoxidativephosphorylationoccurintheinnermembraneofmitochondriawhereasinprokaryotestheprocessoccursintheplasmamembrane.第22頁/共155頁電子傳遞鏈的組成

呼吸電子傳遞鏈主要由蛋白質復合體組成，在線粒體內膜上有4種參與電子傳遞的蛋白質復合體，分別為

NADH－Q還原酶（NADH-Qreductase）琥珀酸－Q還原酶（succinate-Qreductase）細胞色素還原酶（cytochromereductase）細胞色素氧化酶（cytochromeoxidase）第23頁/共155頁洋地黃皂苷第24頁/共155頁Variousprostheticgroupsactasintermediateelectroncarriersintherespiratorychain第25頁/共155頁第26頁/共155頁呼吸鏈的組成1.黃素蛋白酶類（flavoproteins,FP）2.

鐵-硫蛋白類（iron—sulfurproteins)3.輔酶Ｑ（ubiquinone,亦寫作CoQ）4.細胞色素類（cytochromes）5.血紅素

(hemes)6.銅離子（Cu＋）NADH輔酶Q（CoQ）Fe-SCytc1O2CytbCytcCytaa3琥珀酸等黃素蛋白（FAD）黃素蛋白（FMN）細胞色素類鐵硫蛋白（Fe-S）鐵硫蛋白（Fe-S）第27頁/共155頁電子傳遞的方向

在電子傳遞鏈中，有一系列電子傳遞體，這些電子傳遞體的排列順序是根據(jù)它們的電極電位決定的。呼吸鏈中的電子傳遞有著嚴格的方向和順序，即電子從氧化還原電位較低的傳遞體依次通過氧化還原電位較高的傳遞體逐步流向氧分子。第28頁/共155頁ElectronsofNADHandFADH2aretransferredtoO2viamanyintermediateelectroncarriersontheway第29頁/共155頁第30頁/共155頁NADH呼吸鏈NADHFMNCoQFe-SCytc1O2CytbCytcCytaa3Fe-SFADFe-S琥珀酸等復合物Ⅱ復合物Ⅳ復合體I復合物ⅢNADH脫氫酶細胞色素還原酶細胞色素氧化酶琥珀酸-輔酶Q還原酶FADH2呼吸鏈第31頁/共155頁NADH呼吸鏈電子傳遞和水的生成H2O12O2O2-MH2還原型代謝底物FMNFMNH2CoQH2CoQNAD+NADH+H+2Fe2+2Fe3+

細胞色素b-c-c1-aa3

FeS2H+M氧化型代謝底物FADH2呼吸鏈電子傳遞和水的生成2eH2OFADFADH2琥珀酸

FeS2Fe2+2Fe3+

細胞色素b-c1-c-aa3CoQH2CoQ12O2O2-2H+延胡索酸2e第32頁/共155頁電子傳遞鏈各個成員1.NADH－Q還原酶

NADH－Q還原酶又稱為NADH脫氫酶，簡稱為復合體Ⅰ。該酶含有FMN輔基和Fe-S聚簇，催化反應時，先將NADH的電子傳遞到FMN上，再傳給Fe-S聚簇，最后傳給輔酶Q。Fe-S聚簇有幾種類型，含有Fe-S聚簇的蛋白質稱為鐵硫蛋白，又稱為非血紅素鐵蛋白。Fe-S聚簇通過其中的Fe2+和Fe3+的變化來傳遞電子。第33頁/共155頁鐵硫蛋白(簡寫為Fe-S)是一種與電子傳遞有關的蛋白質，它與NADHQ還原酶的其它蛋白質組分結合成復合物形式存在。鐵與無機硫原子或是蛋白質肽鏈上半胱氨酸殘基的硫相結合，常見的鐵硫蛋白有三種組合方式（a）單個鐵原子與4個半胱氨酸殘基上的巰基硫相連。（b）兩個鐵原子、兩個無機硫原子組成（2Fe-2S），其中每個鐵原子還各與兩個半胱氨酸殘基的巰基硫相結合。（c）由4個鐵原子與4個無機硫原子相連（4Fe4S），鐵與硫相間排列在一個正六面體的8個頂角端；此外4個鐵原子還各與一個半胱氨酸殘基上的巰基硫相連。鐵硫蛋白中的鐵可以呈兩價（還原型），也可呈三價（氧化型），由于鐵的氧化、還原而達到傳遞電子作用。第34頁/共155頁Iron-sulfurcenters(Fe-S)areprostheticgroupscontaining1-4ironatomsIron-sulfurcenterstransferonlyoneelectron,eveniftheycontaintwoormoreironatoms.Iron-sulfurCenters(clusters)第35頁/共155頁簡寫為NADHQ還原酶,即復合物I，它的作用是催化NADH的氧化脫氫以及Q的還原。所以它既是一種脫氫酶，也是一種還原酶。它的活性部分含有輔基FMN和鐵硫蛋白。FMN的作用是接受脫氫酶脫下來的電子和質子，形成還原型FMNH2。還原型FMNH2可以進一步將電子轉移給Q。

NADHQ還原酶

NADH+Q+H+=========NAD++QH2第36頁/共155頁Complex1HasNADHbindingsiteNADHreductaseactivityNADH-NAD+NADH--->FMN--->FeS--->ubiquinoneubiquinone--->ubiquinoneH24H+pumped/NADH第37頁/共155頁第38頁/共155頁2.輔酶Q

輔酶Q(CoenzymeQ)又稱泛醌（ubiquinone），有時簡稱為Q或UQ，是一種脂溶性物質，它可以接受1個電子還原成半醌中間體，再接受1個電子還原成對苯二酚形式。它有一個長長的碳氫側鏈，哺乳動物中最常見的是具有10個異戊二烯單位的側鏈，簡寫為Q10，在非哺乳動物中這個側鏈可能只有6-8個異戊二烯單位。由于其脂溶性強，可以在線粒體內膜中擴散。第39頁/共155頁輔酶Q的結構和氧化還原態(tài)第40頁/共155頁3.琥珀酸－Q還原酶

琥珀酸－Q還原酶又稱為復合體Ⅱ，完整的此酶包括檸檬酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶，由4條多肽鏈組成，總的相對分子質量約140×103，含有一個以FAD為輔基的黃素蛋白、2個鐵硫蛋白和一個細胞色素b。其作用是催化電子從琥珀酸通過FAD和鐵硫蛋白傳遞到輔酶Q。所以復合物Ⅱ只能傳遞電子，而不能使質子跨膜輸送。第41頁/共155頁ComplexIIsuccinate---FAD—ubiquinoneContainscoenzymeQFADH2bindingsiteFADreductaseactivityFADH2--FAD第42頁/共155頁ComplexII:Succinate-coenzymeQreductase第43頁/共155頁4.細胞色素還原酶

細胞色素還原酶又稱復合體Ⅲ、輔酶Q－細胞色素c還原酶。它的作用是將還原型輔酶Q的電子傳遞給細胞色素c。細胞色素還原酶中含有細胞色素b，也含有2Fe-2S聚簇。

第44頁/共155頁細胞色素（cytochrome)

細胞色素是一類含有血紅素輔基的電子傳遞蛋白質的總稱。因為有紅顏色，又廣泛存在于生物細胞中，故稱為細胞色素。還原型細胞色素具有明顯的可見光吸收，可以看到α、β和γ三個吸收峰，其中α峰的波長隨細胞色素種類的不同而各有特異的變化，可用來區(qū)分不同的細胞色素。氧化型細胞色素在可見光區(qū)看不到吸收峰。細胞色素中的血紅素有三種，分別稱為細胞色素a、b和c，同一種細胞色素血紅素因結合的蛋白質不同，其α吸收峰的波長會發(fā)生小的變化，如細胞色素還原酶中含有的細胞色素b就分為bH（b562）和bL（b566）兩種。第45頁/共155頁幾種細胞色素的最大吸收峰波長/nm細胞色素αβγa600439bL566bH562532429c550521415c1554524418第46頁/共155頁細胞色素

傳遞電子機理：

+e+eFe3+Fe2+Cu2+Cu+

－e－e

特點：以血紅素為輔基，血紅素的主要成份為鐵卟啉。類別:

根據(jù)吸收光譜分成a、b、c三類，呼吸鏈中含5種（b、c、c1、a和a3)，cytb和cytc1、cytc在呼吸鏈中的中為電子傳遞體，a和a3以復合物物存在，稱細胞色素氧化酶，其分子中除含F(xiàn)e外還含有Cu，可將電子傳遞給氧，因此亦稱其為末端氧化酶。第47頁/共155頁甲?；嗑郛愇於╅L鏈第48頁/共155頁它是電子傳遞鏈中一個獨立的蛋白質電子載體，位于線粒體內膜外表，屬于膜周蛋白，易溶于水。它與細胞色素c1含有相同的輔基，但是蛋白組成則有所不同。在電子傳遞過程中，cyt.c通過Fe3+

Fe2+

的互變起電子傳遞中間體作用。5.細胞色素c第49頁/共155頁復合物Ⅲ的電子傳遞比較復雜，和“Q循環(huán)”有關。輔酶Q能在膜中自由擴散，還原型輔酶Q（氫醌）將一個電子交給Fe-S→細胞色素c1→細胞色素c，被氧化為半醌，并將一個質子釋放到膜間隙，半醌將電子交給細胞色素b566→b562，釋放另外一個質子到膜間隙。一對電子由輔酶Q到復合物Ⅲ的電子傳遞過程中，共有四個質子被轉移到膜間隙，其中兩個質子是輔酶Q轉移的。Q循環(huán)是指在線粒體內膜中電子傳遞鏈上QH2分別傳遞一個電子到細胞色素中，即共使2個細胞色素得到電子，從而被氧化。第50頁/共155頁第51頁/共155頁第52頁/共155頁ComplexIIIubiquinone-ubiquinoneox

whilecytCgetsreducedAlsocontainscytochromesbprotonpump4H+

Addstogradient8H+/NADH4H+/FADH2第53頁/共155頁簡寫為cyt.c氧化酶，即復合物IV，它的作用是將還原型細胞色素c的電子傳遞給分子O2，生成H2O。它是位于線粒體呼吸鏈末端的蛋白復合物，由12個多肽亞基組成。cyt.a和a3組成一個復合體，除了含有鐵卟啉外，還含有銅原子。cyt.aa3可以直接以O2為電子受體。在電子傳遞過程中，分子中的銅離子可以發(fā)生

Cu+

Cu2+

的互變，將cyt.c所攜帶的電子傳遞給O2。6.細胞色素氧化酶第54頁/共155頁

復合物Ⅳ（細胞色素氧化酶）由6-13條多肽鏈組成，總的相對分子質量約60×103-170×103，以二聚體形式存在。每個單體包括細胞色素aa3和含銅蛋白。其作用是催化電子從還原型細胞色素c傳遞給氧分子，同時發(fā)生質子的跨膜移位。所以復合物Ⅳ既是電子傳遞體，又是質子移位體。

第55頁/共155頁ComplexIVreductionofoxygencytochromeoxidasecyta+a3red--->oxidizedstateoxygen--->water2H++2e-+?O2--2H2Otransferse-oneatatimetooxygenPumps2H+outTotalof10H+/NADHTotalof6H+/FADH2第56頁/共155頁ElectronTransportChainGroupsofredoxproteinsOninnermitochondrialmembraneBindingsitesforNADHandFADH2OnmatrixsideofmembraneElectronstransferredtoredoxproteinsNADHreoxidizedtoNAD+FADH2reoxidizedtoFAD第57頁/共155頁4ComplexesproteinsinspecificorderTransfers2electronsinspecificorderProteinslocalizedincomplexesEmbeddedinmembraneEaseofelectrontransferElectronsultimatelyreduceoxygentowater2H++2e-+?O2--H2O第58頁/共155頁第59頁/共155頁ComplexI:NADHentersatNADHdehydrogenase(alsoNADH:ubiquinoneoxidoreductaseorNADH-Qoxidoreductase).(complexII):succinateDehydrogenaseFADH2offlavoproteinsalsotransfertheirelectronstoubiquinone(Q),withnoH+pumped.第60頁/共155頁(ComplexIII)

Cytochromebc1complexpasses2e-from1QH2to2cytochromece-transferring&H+pumpinginComplexIIIviatheQcycle(foreach2e-transferred,4H+arereleasedatthePsideand2H+takenfromtheNside(matrix))ComplexIV:Cytochromecoxidase,theterminalenzymeoftherespiratorychain,contains3Cuand2hemeAgroupsaselectroncarriers第61頁/共155頁Thesequenceofelectroncarriersshouldbe

predictablebasedontheirredoxpotential第62頁/共155頁電子傳遞的抑制效應

凡是能夠阻斷電子傳遞鏈中某部位電子傳遞的物質稱為電子傳遞抑制劑，由于阻斷部位物質的氧化還原狀態(tài)能被測定，所以利用電子傳遞抑制劑是研究電子傳遞順序的重要方法，下面列舉了若干種常見的重要的電子傳遞抑制劑。第63頁/共155頁

1、魚藤酮等

阻斷從NADH向CoQ的傳遞

魚藤酮（rotenone）、安密妥（amytal）、殺粉蝶菌素（piericidine）等。它們的作用是抑制復合物I，阻斷電子由NADH向CoQ的傳遞，但不影響FADH2到CoQ的氫傳遞。魚藤酮是一種極毒的植物毒素，常用作殺蟲劑。第64頁/共155頁

2、抗霉素A

阻斷復合物Ⅲ的電子傳遞抗霉素A（antimycinA），它是從灰色鏈球菌分離出的一種抗生素，抑制復合物Ⅲ的電子傳遞，即阻斷細胞色素還原酶中電子的傳遞，從而抑制了電子從還原型的CoQ（QH2）到細胞色素c1的傳遞。第65頁/共155頁

3、氰化物、疊氮化物、CO、H2S

阻斷復合物IV向O2的傳遞

氰化物（cyanide,CN－）、疊氮化物（azide,N3－）、一氧化碳（carbonmonoxide,CO）和硫化氫(hydrogensulphide)，這些抑制劑均能阻斷電子在細胞色素氧化酶的傳遞，即阻斷細胞色素aa3至O2的電子傳遞，其中氰化物（CN－）和疊氮化物（N3－）能與血紅素a3的高鐵形式（ferricform）作用而形成復合物,而一氧化碳（CO）則抑制血紅素a3的亞鐵形式（ferrousform）。第66頁/共155頁電子傳遞鏈中的抑制劑

第67頁/共155頁

代謝物在生物氧化過程中釋放出的自由能用于合成ATP（即ADP+Pi→ATP）,這種氧化放能和ATP生成（磷酸化）相偶聯(lián)的過程稱氧化磷酸化。類別：

底物水平磷酸化電子傳遞水平磷酸化ADP+PiATP+H2O生物氧化過程中釋放出的自由能二.氧化磷酸化作用第68頁/共155頁

OxidativePhosphorylationConceptOxidativephosphorylationistheprocessinwhichATPisformedasaresultofthetransferofelectronsfromNADHorFADH2toO2byaseriesofelectroncarriers.第69頁/共155頁電子傳遞和氧化磷酸化

檸檬酸循環(huán)及其它降解代謝途徑產(chǎn)生還原型輔酶，包括NADH和FADH2，將其攜帶的電子經(jīng)過電子傳遞，最終交給分子O2，形成H2O。在電子傳遞過程中釋放出大量的自由能，這些自由能被用來推動ATP的合成。在呼吸電子傳遞鏈中，總反應式為

NADH+H++1/2O2

→NAD++H2O

ΔG0’=－220.07kj/molFADH2+1/2O2→FAD+H2O

ΔG0’=－181.58kj/mol

第70頁/共155頁還原型輔酶中的能量

在糖酵解和檸檬酸循環(huán)中，1分子葡萄糖完全氧化可以生成10個NADH和2個FADH2，它們氧化后可以釋放出的自由能為

10×220.07+2×181.58=2563.86

kj/mol

1分子葡萄糖完全氧化釋放的自由能為2870.23kj/mol

還原型輔酶中貯存的能量比例為：

（2563.86/2870.23）×100%=89.3%第71頁/共155頁氧化磷酸化的P/O比

磷氧比（P／O）是指一對電子通過呼吸鏈傳遞到氧所產(chǎn)生ATP的分子數(shù)。近年來很多實驗結果都證明，以NADH作為電子供體時，測得的P/O比值大于2,所以P/O比值不一定是整數(shù)。例如，-羥丁酸經(jīng)過NADH途徑的P/O比值為2.4－2.6，產(chǎn)生的ATP數(shù)目為2.5；而琥珀酸經(jīng)過FADH2的P/O比值為1.7，產(chǎn)生的ATP數(shù)目為1.5。第72頁/共155頁

目前被廣泛接受的觀點是：ATP、ADP和無機磷酸通過線粒體內膜的轉運是由ATP-ADP載體和磷酸轉位酶催化的。每合成1個ATP需要3個質子通過ATP合酶。同時，把一個ATP分子從線粒體基質轉運到胞液需要消耗1個質子，所以每形成1分子ATP就需要4個質子的流動。因此，如果一對電子通過NADH電子傳遞鏈可泵出10個質子，則可形成2.5個分子ATP；如果一對電子通過FADH2電子傳遞鏈有6個質子泵出，則可形成1.5個ATP分子。第73頁/共155頁底物水平磷酸化：代謝物通過氧化形成的高能磷酸化合物直接將磷酸基團轉移給ADP，使之磷酸化生成ATP。

氧化磷酸化：NADH或FADH2將電子傳遞給O2的過程與ADP的磷酸化相偶聯(lián)，使電子傳遞過程中釋放出的能量用于ATP的生成。氧化磷酸化的過程需要氧氣作為最終的電子受體，它是需氧生物合成ATP的主要途徑。第74頁/共155頁

20世紀30年代包括德國生物化學家、諾貝爾獎獲得者Meyerhof&Warburg在內的許多生化學家對代謝過程中能量的產(chǎn)生和利用作了深入研究，發(fā)現(xiàn)無論在糖酵解或三羧酸循環(huán)等代謝過程中，都有伴隨著ATP磷酸根的放出或

ADP得到磷酸根的變化這類化學能量高效率的傳遞方式，指出腺苷三磷酸（ATP）是代謝中能量產(chǎn)生和利用的關鍵化合物。第75頁/共155頁

1941年FritzLipmann引入“高能磷酸鍵

(～P)”的概念。1949年美國生化學家EugeneKennedy和AlbertLehninger發(fā)現(xiàn)線粒體含有三羧酸循環(huán)和呼吸鏈所需要的全部酶系統(tǒng)，并且發(fā)現(xiàn)生物氧化與ADP磷酸化相偶聯(lián)構成了氧化磷酸化。但是，NADH的氧化和電子傳遞過程是如何與ADP磷酸化生成ATP反應偶聯(lián)起來一直不清楚。第76頁/共155頁氧化磷酸化的偶聯(lián)機理

1、線粒體ATP合酶（mitochondrialATPase）2、能量偶聯(lián)假說

1953年EdwardSlater

化學偶聯(lián)假說

1964年PaulBoyer

構象偶聯(lián)假說

1961年PeterMitchell

化學滲透假說3、質子梯度的形成4、ATP合成的機制1978年獲諾貝爾化學獎第77頁/共155頁ATP的合成部位

線粒體內膜上有許多球形突起，稱為內膜球體（innermembranesphere）。這些球體通過一個柄連接到內膜中的基座上，我們把球體和柄合稱為F1，基座稱為Fo，F(xiàn)1和Fo合稱復合體Ⅴ。在離體條件下，這種復合體有水解ATP的活性，所以開始稱它為ATP酶，后來發(fā)現(xiàn)在完整的線粒體中它的功能是合成ATP，現(xiàn)在稱它為ATP合酶。第78頁/共155頁

ATP產(chǎn)生的部位都是有大的電位差變化的地方，例如，NADH呼吸鏈生成ATP的三個部位是：E0'值在此三個部位有大的“跳動”，都在0.2伏以上。ATP產(chǎn)生的部位第79頁/共155頁電子傳遞鏈標準氧還電勢、自由能變化和ATP形成部位示意圖第80頁/共155頁第81頁/共155頁線粒體ATP合酶第82頁/共155頁超聲波胰蛋白酶或尿素第83頁/共155頁電子傳遞形成跨膜的質子梯度

在電子傳遞過程中，還伴隨有H+從線粒體內膜的基質側，向內膜的外側運輸，結果造成跨線粒體內膜的質子梯度，這樣在膜內外既造成質子的濃度梯度，又造成電勢梯度，這種電化學勢梯度貯存有能量，當質子由膜的外側向內側運動時，推動ATP合成。

第84頁/共155頁GenerationofATPProtondependantATPsynthetaseUsesprotongradienttomakeATPProtonspumpedthroughchannelonenzymeFromintermembranespaceintomatrix~4H+/ATPCalledchemiosmotictheory第85頁/共155頁比較著名的假說有三個：

化學偶聯(lián)假說構象偶聯(lián)假說化學滲透學說目前得到公認的是“化學滲透學說”。氧化磷酸化-能量偶聯(lián)的機理第86頁/共155頁

這個假說是1953年由EdwardSlater最先提出。假說認為在NADH氧化和電子傳遞過程中產(chǎn)生了一種活潑的高能共價中間物，通過此中間物進一步氧化產(chǎn)生的能量來驅動ATP的合成。這一假說完全是依據(jù)底物水平磷酸化機理提出的，例如在糖酵解中，由3-磷酸甘油醛脫氫酶催化的反應就產(chǎn)生了一種活潑且具有高能磷酸基轉移勢能的?；姿峄衔?，3-二磷酸甘油，隨后其分子中的高能磷酸基團在磷酸甘油酸激酶的作用下被轉移到ADP生成ATP。雖然在糖酵解過程中存在這種例證，但是人們至今未能在線粒體中分離到與之相類似的高能共價中間物。化學偶聯(lián)假說Chemicalcouplinghypothesis第87頁/共155頁

這個假說是1964年由P.D.Boyer提出。該假說認為作為電子傳遞體的蛋白質有兩種不同的構象：低能構象和高能構象。電子傳遞的結果使低能構象轉變?yōu)楦吣軜嬒?，后者再將能量傳遞給F0-F1-ATP合成酶，使之也發(fā)生構象變化，從而推動ADP磷酸化形成ATP。這種假說有一定的實驗根據(jù)，在電子沿呼吸鏈流動時，觀察到線粒體內膜發(fā)生迅速的物理變化，但由于測定構象比較困難，支持這個假說的實驗太少。構象偶聯(lián)假說Conformationalcouplinghypothesis第88頁/共155頁

英國生物化學家PeterDMitchell在1961年提出化學滲透假說，他認為電子傳遞釋放出的自由能及ATP合成是與一種跨線粒體內膜的質子梯度相偶聯(lián)的。也就是說，電子傳遞釋放的自由能驅動H+從線粒體基質跨過內膜進入到膜間隙，從而形成跨線粒體內膜的H+電化學梯度。這個梯度的電化學勢驅動ATP合成。由于該假說提出后逐漸擁有越來越多的實驗證據(jù)，因而成為目前解釋氧化磷酸化偶聯(lián)機理最為公認的一種假說，并且PeterMitchell因提出該假說而獲得了1978年的諾貝爾化學獎。

化學滲透學說Chemiosmotichypothesis第89頁/共155頁TheNobelPrizeforChemistryin1978PeterMitchell(1920-1992)MechanismofcoupledoxidativephosphorylationChemiosmotichypothesisIn1961,PeterMitchellproposedanovelidea-aprotongradientacrosstheinnermembranecouldbeusedtodriveATPsynthesis.第90頁/共155頁第91頁/共155頁

由上述化學滲透假說可知，該模型必需具備兩個條件：一是線粒體內膜必須是質子不能透過的封閉系統(tǒng)，否則質子梯度將不復存在；二是要求呼吸鏈和ATP合酶在線粒體內膜中定向地組織在一起，并定向地傳遞質子、電子和進行氧化磷酸化反應。

第92頁/共155頁化學滲透假說的實驗證據(jù)①

氧化磷酸化作用需要封閉的線粒體內膜存在。②線粒體內膜對H+、OH－、K+、Cl－等離子都是不通透的。③破壞H+濃度梯度的形成都必將破壞氧化磷酸化作用的進行。④線粒體內膜上的電子傳遞能夠將H+從基質運輸?shù)侥らg隙。⑤人造的脂質小泡上重組細菌紫膜質和F1FoATP合酶后，在照光時有ATP的合成。第93頁/共155頁質子泵出是需能過程

一個質子逆電化學梯度跨過線粒體內膜的自由能變化可以用下式表示ΔG=2.3RT[pH(膜內)－pH(膜外)]＋ZFΔΨ

式中，ΔΨ是膜電勢，即膜內外的電勢差。

ΔΨ=Ψ(膜外)－Ψ(膜內)第94頁/共155頁質子轉移的兩種假設機制（1）氧化－還原回路機制

該機制由Mitchell提出。他認為電子傳遞鏈中有一些電子傳遞體既可以傳遞電子，也可以結合H+，當它們被還原時，在膜內側結合H+，而被氧化時，在膜外側釋放H+，這樣就把H+從膜內運到了膜外。

第95頁/共155頁（2）質子泵機制

這個機制的內容是，電子傳遞導致復合體構象的變化，氨基酸殘基在膜內側結合H+，構象變化后在膜外側釋放H+，從而把H+從膜內側運到膜外。第96頁/共155頁合成ATP與跨膜質子的數(shù)量關系

在生理條件下合成1個ATP所需的自由能大約為40～50kj/mol。至少需要兩個質子跨膜回流釋放的能量才夠合成1個ATP。因為轉移出膜外的質子有一部分漏回膜內，測定的結果表明，每合成1個ATP需要泵出2～3個質子。

第97頁/共155頁ElectronTransportThusCapturesEnergyasProton-MotiveForceDy=0.15-0.2V0.75pHunitshigherthanP-side10protonsarepumpedout,whichconservesabout200kJ/mol(ofNADH)aselectrochemicalpotentialWhenprotonsareallowedtoflowbackin,workcanbeperformed:thesynthesisofATP第98頁/共155頁

ProtonPumpingComplexesI,III,andIV“pump”protonsfromthemitochondrialmatrixspacetotheintermembranespace.ComplexIpumps4,complexIIIpumps4,andcomplexIVpumps2protonsperpairofelectronstransported.ProtonMotiveForceAgradientofprotonsiscreatedacrosstheinnermitochondrialmembranebytheelectrontransportchain.ItistheenergystoredinthisgradientthatislinkedtothesynthesisofATPfromADPandPi.

第99頁/共155頁F1和Fo的亞基組成

F1由5種肽鏈組成，α3β3γδε。Fo由3種疏水亞基組成，a1b2c9-12。Fo形成跨膜的管道，質子通過此管道流回到膜內側時驅動ATP合成。F1的α、β、γ、δ和ε亞基分別由510、482、272、146和50個氨基酸殘基組成，F(xiàn)1的總分子量為371kD。α、β亞基是同源的，每一個亞基結合有1個ATP，催化位點在β亞基上，α亞基上ATP結合位點的功能還不清楚，因為缺失這個位點并不影響F1的活性。第100頁/共155頁F1/F0ATPSynthaseF1

catalyticsubunit,madeof5polypeptides

a3b3gde.Focomplexofintegralmembraneproteinsthatmediatesprotontransport,madeof

a1b2c9-12F0isoriginally"F-o"foritsinhibitionbyoligomycinProtondiffusionthroughtheproteindrivesATPsynthesis第101頁/共155頁ATPsynthasecomprisesaprotonchannel(Fo)andanATPase(F1)F1:a3b3gde.Fo:ab2c10-12第102頁/共155頁

該假說是1964年由美國生物化學家PaulBoyer最先提出，他認為電子傳遞過程中，線粒體內膜上的蛋白質組分發(fā)生了構象變化，轉變成一種高能形態(tài)。這種高能形態(tài)通過將能量轉移到ADP合成ATP后，又得以恢復其原來的構象。隨著人們對ATP合酶結構的研究和認識不斷深入，在構象偶聯(lián)假說的基礎上形成了ATP合酶結合變化和旋轉催化假說。

ATP酶-構象偶聯(lián)假說第103頁/共155頁Boyer和Walker的工作

英國科學家Walker通過x光衍射獲得高分辯率的牛心線粒體ATP酶晶體的三維結構，證明在ATP酶合成ATP的催化循環(huán)中三個β亞基的確有不同構象，從而有力地支持了Boyer的假說。

Boyer和Walker共同獲得1997年諾貝爾化學獎。

美國科學家Boyer為解釋ATP酶作用機理,提出旋轉催化假說，ATP合酶結合變化和旋轉催化假說認為，ATP合酶與底物核苷酸的作用是按照結合變化機理進行的。構成ATP合酶頭部的α3β3亞基構成3個催化部位，中部的γε亞基在質子推動力的驅動下相對于α3β3作旋轉運動認為ATP合成酶β亞基有三種不同的構象，一種構象(L)有利于ADP和Pi結合，一種構象(T)可使結合的ADP和Pi合成ATP，第三種構象(O)使合成的ATP容易被釋放出來。在ATP合成過程中，三個β亞基依次進行上述三種構象的交替變化，所需能量由跨膜H+提供。第104頁/共155頁

當質子推動力驅使H+經(jīng)F0質子通道進入時，F(xiàn)0組分質子化而發(fā)生構象改變，積累足夠的扭矩力，推動γε相對α3β3旋轉120°，使處于T態(tài)的催化部位釋放ATP變成O態(tài)，同時L態(tài)催化部位上生成ATP變?yōu)門態(tài)，O態(tài)結合ADP+Pi變?yōu)長態(tài)側面觀頂面觀第105頁/共155頁ATP酶作用機理

ADP+PiProtenFluxH+ATP+H2O

ATPADP+PiProtenFlux有于ADP與Pi結合的構象有于ADP與Pi生成的構象有利于ATP釋放的構象第106頁/共155頁第107頁/共155頁分子馬達

Fo的c亞基排列成環(huán)，c亞基的構象是一對反平行的跨膜螺旋，在胞質溶膠側由一個短的發(fā)卡環(huán)連接。c亞基環(huán)形成一個轉子（rotor），相對于a亞基旋轉，a亞基作為定子（stater），a亞基由5個跨膜的α螺旋組成，在膜的每一側有質子流動的通道（protonaccesschannels）。γ亞基將F1和Fo連接起來，在ATP合成時γ亞基也相對于(αβ)3復合體旋轉。如果γ亞基固著在c亞基轉子上，它們就可以一起轉動。b亞基有1個跨膜片段和1個長的親水頭部，完整的定子由b亞基固著在a亞基的一端，并通過δ亞基與(αβ)3結合在一起。

第108頁/共155頁第109頁/共155頁

解偶聯(lián)劑（uncoupler）是指那些不阻斷呼吸鏈的電子傳遞，但能抑制ADP通過磷酸化作用轉化為ATP的化合物。它們也被稱為氧化磷酸化解偶聯(lián)劑。最早發(fā)現(xiàn)的一個解偶聯(lián)劑是2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol,DNP），它是一種弱酸性親脂化合物，在pH7條件下，DNP以解離形式存在，不能通過線粒體內膜。但是在酸性環(huán)境中，DNP轉變?yōu)橹苄缘姆墙怆x形式，可攜帶質子透過線粒體內膜，這樣就破壞了電子傳遞形成的跨膜質子電化學梯度。氧化磷酸化的解偶聯(lián)和抑制第110頁/共155頁

在解偶聯(lián)劑存在時，電子沿呼吸鏈的傳遞能正常進行，但不能偶聯(lián)產(chǎn)生ATP，這樣就使電子傳遞所產(chǎn)生的自由能以熱能的形式被消耗。由于DNP解偶聯(lián)劑只專一性地抑制與呼吸鏈相偶聯(lián)的ATP的形成過程，因此，它不會影響底物水平的磷酸化。1．解偶聯(lián)劑（uncouplers）

NO2NO2O-NO2NO2OHNO2NO2O-NO2NO2OHH+H+線粒體內膜內外第111頁/共155頁

這類化合物直接作用于ATP合酶復合體，從而抑制ATP的合成。

它們使膜外質子不能通過ATP合酶復合體返回膜內，使膜內質子繼續(xù)泵出到膜外顯然越來越困難，最后不得不停止，所以這類抑制劑間接抑制了電子傳遞和分子氧的消耗。

寡霉素屬于此類抑制劑，它與F0的一個亞基結合而抑制F1。2．氧化磷酸化抑制劑（inhibitors）第112頁/共155頁F1FoATP合酶的抑制劑

在ATP合酶的柄部有一種寡霉素敏感性付于蛋白(oligomycin-sensitivity-conferringprotein，OSCP)，這種蛋白使復合體對寡霉素敏感，使得寡霉素抑制ATP的合成。Fo的名稱即來自于此。

二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodi-imide，DCCD）能夠修飾Fo蛋白中某亞基的Glu殘基，導致抑制質子通過Fo，這種能被DCCD修飾的蛋白又稱為DCCD－結合蛋白。第113頁/共155頁3.離子載體抑制劑

離子載體抑制劑（ionophore）是指那些能與某種離子結合，并作為這些離子的載體攜帶離子穿過線粒體內膜的脂雙層進入線粒體的化合物。這類抑制劑均是脂溶性物質，它們與解偶聯(lián)劑的區(qū)別在于它們能結合除H+以外的其它一價陽離子，例如纈氨霉素（Valinomycin）可結合K+，短桿菌肽可結合K+、Na+和其它一價陽離子穿過線粒體內膜。因此離子載體抑制劑增大了線粒體內膜對一價陽離子的通透性，從而破壞了膜兩側的電位梯度，最終導致氧化磷酸化過程被抑制。第114頁/共155頁第115頁/共155頁線粒體外NADH的氧化磷酸化作用

酵解（細胞質）氧化磷酸化

（線粒體）

線粒體外的NADH通過間接的途徑——

穿梭機制進入線粒體。動物細胞內已知有兩個穿梭系統(tǒng)：

磷酸甘油穿梭系統(tǒng)，主要存在于肌細胞；

蘋果酸穿梭系統(tǒng)，主要存在于肝細胞。

第116頁/共155頁OxidationofNADHinCytosolGlycerophosphateshuttle(muscle)Malate-aspartateshuttle(liver)第117頁/共155頁磷酸甘油穿梭系統(tǒng)

通過3-磷酸甘油與DHAP之間的轉換，胞液中的NADH間接地轉變?yōu)閮饶ど系腇ADH2，經(jīng)由內膜上的3-磷酸甘油脫氫酶(也是以FAD為輔基的黃素蛋白)進入FADH2呼吸鏈。這種方式不通過復合物Ⅰ,因此只生成1.5分子ATP。第118頁/共155頁-磷酸甘油穿梭（線粒體基質）磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油磷酸二羥丙酮3-磷酸甘油FADFADH2NADHFMNCoQbc1caa3O2NADHNAD+線粒體內膜（細胞液）第119頁/共155頁Points:

Differentco-enzymeofglycerol-3-phosphatedehydrogenaseCytosol-----NAD+Mitochondria---FADFADH2:succinaterespiratorychaintocreate1.5ATPLocation:skeletalmuscle、nervecellGlycerophosphateshuttle第120頁/共155頁蘋果酸穿梭系統(tǒng)

谷草轉氨酶，蘋果酸脫氫酶，以及一系列的透性酶。通過蘋果酸與草酰乙酸之間的轉換，間接地將細胞質中的NADH轉變?yōu)榫€粒體內的NADH，從而進入NADH呼吸鏈。這種方式要通過復合物Ⅰ。第121頁/共155頁蘋果酸-草酰乙酸穿梭作用細胞液線粒體內膜體天冬氨酸-酮戊二酸蘋果酸草酰乙酸谷氨酸-酮戊二酸天冬氨酸蘋果酸谷氨酸NADH+H+NAD+草酰乙酸NAD+線粒體基質蘋果酸脫氫酶NADH+H+ⅣⅠⅡⅢ蘋果酸脫氫酶谷草轉氨酶谷草轉氨酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為膜上的轉運載體）呼吸鏈第122頁/共155頁第123頁/共155頁PointsCo-enzymeofMalatedehydrogenase:NAD+OxaloacetateinmitochondriaformaspartatetoexitfrommitochondrialmembraneNADHrespiratorychain:2.5ATPLocation:liver,myocardium

Malate-aspartateshuttle第124頁/共155頁Factorsaffectingoxidation

phosphorylationInhibitorsRegulationbyADPThyroidhormoneMitchondrialDNAmutation第125頁/共155頁Inhibitors

Inhibitorsofrespiratorychaine.g.rotenone、piericidinAandamobarbital,antimycinA,dimercaptopropanol(BAL)Uncouplere.g.dinitrophenol，DNPInhibitorsofoxidativephosphorylationinhibitingbothelectrontransportandADPphosphorylation.e.g.oligomycin第126頁/共155頁

電子傳遞受可用底物量和ADP量的調控。既無可氧化的底物又無ADP時為狀態(tài)Ⅰ，加入ADP后為狀態(tài)Ⅱ（無可用的底物），加入底物后為狀態(tài)Ⅲ，ADP用完后為狀態(tài)Ⅳ，再加入ADP后為狀態(tài)Ⅲ，氧耗盡后為狀態(tài)Ⅴ。RegulationbyADP第127頁/共155頁ThyroidHormoneNa+-K+ATPenzyme

ATPdegradation

ADP/ATPOxidativephosphorylation第128頁/共155頁MitchondrialDNAMutationCausedbyrelativelynakedmitochondrialDNAAffectingoxidativephosphorylationleadtoATPdecreaseSymptomsaredependentonthedifferentorgansneedforATP,e.gDM、hypertension、

Highcholesterol、Mg++downregulationMaternallyinheriteddiseases，Age-related第129頁/共155頁第130頁/共155頁Bioenergyischemicalenergy,studiedintermsoffreeenergyandfreeenergychange(G).ATPactsasthefreeenergycarrierincells.Bioenergyismainlyproducedviastepwiseelectronflow(redoxreactions)throughaseriesofelectroncarriershavingincreasinglevelsofreductionpotential(E).Electronsreleasedfromtheoxidationofnutrientfuelsareinitiallychanneledtoafewuniversalelectroncarriers(includingNADHandFADH2).Summary第131頁/共155頁ElectronscollectedinNADHandFADH2arereleased(atdifferententeringpoints)andtransportedtoO2viatherespiratorychain,whichconsistsoffourmultiproteincomplexes(I,II,III,andIV)andtwomobileelectroncarriers(ubiquinoneandcytochromec).Theorderofthemanyelectroncarriersontherespiratorychainhavebeenelucidatedviavariousstudies,includingmeasurementsofthestandardreductionpotentialandeffectsofvariousrespiratorychaininhibitors.第132頁/共155頁ElectrontransfertoO2wasfoundtobecoupledtoATPsynthesisfromADP+Piinisolatedmitochondria.ThechemiosmotictheoryexplainsthecouplingofelectronflowandATPsynthesis.ATPsynthasecomprisesaprotoncha