蛋白質(zhì)化學(xué)課件

第一章蛋白質(zhì)化學(xué)

蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)的氨基酸組成肽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象并具有一定生物功能的大分子。一、蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義1.生物體的組成成分2.酶3.運(yùn)輸4.運(yùn)動(dòng)5.抗體6.干擾素7.遺傳信息的控制8.細(xì)胞膜的通透性9.高等動(dòng)物的記憶、識別機(jī)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的元素組成C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、S（0~4%）、…N的含量平均為16%——?jiǎng)P氏（Kjadehl）定氮法的理論基礎(chǔ)三、蛋白質(zhì)的氨基酸組成氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。從細(xì)菌到人類，所有蛋白質(zhì)都由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（20standardaminoacids)組成。（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：19種氨基酸具有一級氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）結(jié)合到α碳原子（Cα），同時(shí)結(jié)合到（Cα）上的是H原子和各種側(cè)鏈（R）；Pro具有二級氨基（α-亞氨基酸）不帶電形式

H2N—Cα—HCOOHR+H3N—Cα—HCOO-R兩性離子形式Cα如是不對稱C（除Gly），則：具有兩種立體異構(gòu)體[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]（二）氨基酸的分類1、按照R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類（1）、R為脂肪烴基的氨基酸（5種）R基均為中性烷基，R基對分子酸堿性影響很小，它們幾乎有相同的等電點(diǎn)。（6.0±0.03）Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性從Gly至Ile，R基團(tuán)疏水性增加（2）、

R中含有羥基和硫的氨基酸（共4種）Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理?xiàng)l件下不解離，，但在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在。

Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白?！顲ys的R中含巰基（-SH），具有兩個(gè)重要性質(zhì)：（1）在較高pH值條件，巰基離解。（2）兩個(gè)Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。

u

Cys與結(jié)石★Met在生物合成中是一種重要的甲基供體。（3）、

R中含有酰胺基團(tuán)（2種）酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)（4）、R中含有酸性基團(tuán)（2種）Asp、GluAsp側(cè)鏈羧基pKa為3.86，Glu側(cè)鏈羧基pKa為4.25它們是唯一在生理?xiàng)l件下帶有負(fù)電荷的的兩個(gè)

氨基酸

（5）、

R中含堿性基團(tuán)（3種）Lys側(cè)鏈氨基的pKa為10.53，生理?xiàng)l件下，Lys側(cè)鏈帶有一個(gè)正電荷（—NH3+），側(cè)鏈的氨基反應(yīng)活性增大。Arg是堿性最強(qiáng)的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿，pKa值為12.48，生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化。His是pKa值最接近生理pH值的一種（游離氨基酸中為6.00，在多肽鏈中為7.35），是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。His在酶的酸堿催化機(jī)制中起重要作用在280nm處，Trp吸收最強(qiáng)，Tyr次之，Phe最弱。（6）、

芳香族氨基酸（7）、雜環(huán)族氨基酸（2種）Pro的α-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)。一般出現(xiàn)在兩段α-螺旋之間的轉(zhuǎn)角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化，u

必需氨基酸：成年人：Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Lys、Met

嬰兒期：Arg和His供給不足，屬半必須氨基酸根據(jù)R的極性分類氨基酸非極性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp極性氨基酸：不帶電：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；帶正電：His、Lys、Arg；帶負(fù)電：Asp、Glu非極性氨基酸

不帶電荷的極性氨基酸6種這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水帶負(fù)電荷的aa(酸性aa)（4）、帶正電何的aa(堿性aa)不常見的蛋白質(zhì)氨基酸（三）氨基酸的重要理化性質(zhì)一般物理性質(zhì)無色晶體，熔點(diǎn)極高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差別較大（極性和非極性），不溶于有機(jī)溶劑。兩性解離和等電點(diǎn)氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時(shí)都以離子形式存在，在同一個(gè)氨基酸分子上帶有能放出質(zhì)子的—NH3+正離子和能接受質(zhì)子的—COO-負(fù)離子，為兩性電解質(zhì)。調(diào)節(jié)氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解離程度完全相等時(shí)，即所帶凈電荷為零，此時(shí)氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)（pI）。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶體狀態(tài)或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在堿性溶液中的氨基酸（pH＞pI）（當(dāng)氨基酸相互連接成蛋白質(zhì)時(shí)，只有其側(cè)鏈基團(tuán)和末端的α-氨基，α-羧基是可以離子化的。兩性∵氨基酸既含有－NH2，又含有－COOH∴它既能與酸成鹽：

又能與堿成鹽：實(shí)際上，氨基酸分子以內(nèi)鹽形式存在：等電點(diǎn)

當(dāng)AA溶于水時(shí)，－COOH與－NH2都可電離：但－COOH和－NH2的電離程度不同。通常，電離程度：－COOH＞－NH2

加酸或加堿于氨基酸水溶液中，可調(diào)節(jié)－COOH和－NH2的電離程度，使－COOH和－NH2的電離程度相同，此時(shí)溶液的pH值稱為氨基酸的等電點(diǎn)：等電點(diǎn)的定義：

①氨基酸溶液中羧基與氨基的電離程度相同時(shí)溶液的pH值。②氨基酸在溶液中以偶極離子存在時(shí)，溶液的pH值。③在電場中，氨基酸既不向陰極移動(dòng)，也不向陽極移動(dòng)時(shí)，氨基酸溶液的pH值。不同的氨基酸，其等電點(diǎn)不同等電點(diǎn)時(shí)，AA溶解度最小，最容易從溶液中析出。利用等電點(diǎn)，可分離各種不同的氨基酸。

氨基酸等電點(diǎn)的確定：1）酸堿滴定（滴定曲線）2）根據(jù)pK值（該基團(tuán)在此pH一半解離）計(jì)算：等電點(diǎn)等于兩性離子兩側(cè)pK值的算術(shù)平均數(shù)。pI=————pK1+pK22or（pI=————）pK2+pK32等電點(diǎn)的計(jì)算中性氨基酸：以Gly為例K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI時(shí)，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+][H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly酸性氨基酸，以Asp為例：堿性氨基酸，以Lys為例：

如含兩個(gè)手性碳原子，則有４種立體異構(gòu)體，分別稱為Ｄ-,Ｌ-，Ｄ別-和Ｌ別-氨基酸。L-蘇氨酸(L-threonine)D-蘇氨酸(D-threonine)L-別-蘇氨酸(L-allo-threonine)D-別-蘇氨酸(D-allo-threonine)旋光性：

組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，

所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋轉(zhuǎn)，向左旋轉(zhuǎn)的稱左旋，用“一”號表示，向右旋轉(zhuǎn)的稱右旋，用“＋”號表示。旋光度，比旋光度消旋外消旋內(nèi)消旋光吸收：

組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，Trp、Tyr和Phe對紫外光有一定的吸收，這是因?yàn)樗鼈兎肿又泻斜江h(huán)，是苯環(huán)的共軛雙鍵造成的，這三個(gè)氨基酸的光吸收都在280nm附近。3.化學(xué)性質(zhì)（1）與茚三酮的反應(yīng)：Pro產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它為藍(lán)紫色。在570nm（藍(lán)紫色）或440nm（黃色）定量測定（幾μg）。（2）與甲醛的反應(yīng)：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2羥甲基氨基酸二羥甲基氨基酸（3）與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)NO2FO2N+HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱堿性DNP-氨基酸DNP多肽水解DNP-氨基酸經(jīng)紙層析，可以鑒定N端氨基酸H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸取代DNFB測定蛋白質(zhì)N端氨基酸，靈敏度高酰基化反應(yīng)酰氯：芐氧酰氯（Cbz-Cl）:對甲苯磺酰氯(Tos-Cl):叔丁氧酰氯(Boc-Cl):酸酐：鄰苯二甲酸酐：（R’＝?；?）與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng)—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF重復(fù)測定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設(shè)計(jì)出“多肽順序自動(dòng)分析儀”（5）與熒光胺反應(yīng)：根據(jù)熒光強(qiáng)度測定氨基酸含量（ng級）。激發(fā)波長λx=390nm，發(fā)射波長λm=475nm。（6）與5,5′-雙硫基-雙（2-硝基苯甲酸）反應(yīng)：H2N—CHCH2SSHNO2HOOCSNO2COOHCOOH+SSNO2NO2HOOCCOOHH2N—CH—COOH+CH2SHpH8.0硫代硝基苯甲酸測定Cys含量（pH8.0λ412nm的摩爾消光系數(shù)ε=13600）（7）苯環(huán)的黃色反應(yīng)phe+少量濃H2SO4+濃HNO3

黃色TyrorTrp+濃HNO3

黃色（8）酚基的Millon反應(yīng)（米倫氏反應(yīng)）HgNO3

Tyr+ Hg(NO3)2

紅色HNO3

（9）pauly反應(yīng)His+重氮苯磺酸紅色（棕紅色）Tyr+重氮苯磺酸橘黃色（10）Folin一酚反應(yīng)+磷鉬酸Tyr磷鎢酸orTrp藍(lán)色（鉬藍(lán)與鎢藍(lán)混合物）紙層析

單向紙層析圖Rf值

四、肽（peptide）肽的結(jié)構(gòu)和命名

肽是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸通過肽鍵連接而形成的化合物。Peptidebond氨基酸之間通過肽鍵連接形成的鏈稱肽鏈。N端氨基酸殘基氨基酸殘基C端肽鏈書寫方式：N端→C端

肽鏈有鏈狀、環(huán)狀和分支狀。（一）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG（二）催產(chǎn)素和升壓素

均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產(chǎn)和促使乳腺排乳作用。升壓素促進(jìn)血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。（三）促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）39肽，活性部位為第4~10位的7肽片段：

Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（四）腦肽腦啡肽具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛作用（強(qiáng)于嗎啡），不上癮。Met-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-內(nèi)啡肽（31肽）具有較強(qiáng)的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。（五）膽囊收縮素（六）胰高血糖素由胰島α-細(xì)胞分泌（β-細(xì)胞分泌胰島素），29肽。胰高血糖素調(diào)節(jié)維持血糖濃度。五、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)是氨基酸以肽鍵相互連接的線性序列。在蛋白質(zhì)中，多肽鏈折疊形成特殊的形狀（構(gòu)象）（conformation）。在結(jié)構(gòu)中，這種構(gòu)象是原子的三維排列，由氨基酸序列決定。蛋白質(zhì)有四種結(jié)構(gòu)層次：一級結(jié)構(gòu)（primary），二級結(jié)構(gòu)（secondary），三級結(jié)構(gòu)（tertiary）和四級結(jié)構(gòu)（quaternary）（不總是有）。（一）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)）一級結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序，即氨基酸的線性序列。在基因編碼的蛋白質(zhì)中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的。一級結(jié)構(gòu)中包含的共價(jià)鍵（covalentbonds）主要指肽鍵（peptidebond）和二硫鍵（disulfidebond）HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB鏈15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A鏈711621SSSS牛胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)—S————S——一級結(jié)構(gòu)確定的原則：將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重疊位點(diǎn)，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質(zhì)的完整序列。目前往往采用從待測蛋白質(zhì)的基因序列反推出蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。（二）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)）——蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間的排列分布和肽鏈的走向。由于羰基碳-氧雙鍵的靠攏，允許存在共振結(jié)構(gòu)（resonancestructure），碳與氮之間的肽鍵有部分雙鍵性質(zhì)，由CO-NH構(gòu)成的肽單元呈現(xiàn)相對的剛性和平面化，肽鍵中的4個(gè)原子和它相鄰的兩個(gè)α-碳原子多處于同一個(gè)平面上。Cα—C—N—CαOH—CN—O-H+CαCα氨基的H與羰基的O幾乎總是呈反式（trans）而不是順式（cis）。蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定的原因：1）酰胺平面；2）R的影響。5肽

名稱：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸寫法：ＮSer-Gly--Try-AlaLeu或ＳＧＹＡＬ，肽（peptide）

肽是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸通過肽鍵連接而形成的化合物。PeptidebondCCα3Cα2Cα1CNNHHHOOR肽平面1肽平面2肽平面及其旋轉(zhuǎn)ψΦ★多肽鏈可以看成由Cα串聯(lián)起來的無數(shù)個(gè)酰胺平面組成1.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)——指蛋白質(zhì)多肽鏈本身的折疊和盤繞方式（1）α-螺旋（α-helix）Pauling和Corey于1965年提出。結(jié)構(gòu)要點(diǎn)：1）螺旋的每圈有3.6個(gè)氨基酸，螺旋間距離為0.54nm，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100°。2）每個(gè)肽鍵的羰基氧與遠(yuǎn)在第四個(gè)氨基酸氨基上的氫形成氫鍵（hydrogenbond），氫鍵的走向平行于螺旋軸，所有肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成。—C—(NH—C—CO)3N—OHHR3.613(ns)3)R側(cè)鏈基團(tuán)伸向螺旋的外側(cè)。RRRRRRRRR螺旋的橫截面4）Pro的N上缺少H，不能形成氫鍵，經(jīng)常出現(xiàn)在α-螺旋的端頭，它改變多肽鏈的方向并終止螺旋。

R側(cè)鏈對α—螺旋的影響①多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸殘基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成穩(wěn)定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。②Gly在肽中連續(xù)存在時(shí)，不易形成α—螺旋。③R基大（如Ile）不易形成α—螺旋④Pro、脯氨酸中止α—螺旋。⑤R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α—螺旋。（2）β-折疊結(jié)構(gòu)（β-pleatedsheet）是一種肽鏈相當(dāng)伸展的結(jié)構(gòu)。肽鏈按層排列，依靠相鄰肽鏈上的羰基和氨基形成的氫鍵維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。肽鍵的平面性使多肽折疊成片，氨基酸側(cè)鏈伸展在折疊片的上面和下面。CαCαCαCαCαCαRRRRRRNNCNNCCC平行反平行β-折疊片中，相鄰多肽鏈平行或反平行（較穩(wěn)定）。（3）β-轉(zhuǎn)角（β-turn）為了緊緊折疊成緊密的球蛋白，多肽鏈常常反轉(zhuǎn)方向，成發(fā)夾形狀。一個(gè)氨基酸的羰基氧以氫鍵結(jié)合到相距的第四個(gè)氨基酸的氨基氫上。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-轉(zhuǎn)角經(jīng)常出現(xiàn)在連接反平行β-折疊片的端頭。（4）自由回轉(zhuǎn)沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)。酶的活性部位。2.超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級結(jié)構(gòu)是指若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體。是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)至三級結(jié)構(gòu)層次的一種過渡態(tài)構(gòu)象層次。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。多肽鏈在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結(jié)構(gòu)，具有部分生物功能。對于較大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)域締合而成三級結(jié)構(gòu)。α-螺旋

(α-helix)β-折疊

(β-

pleatedsheet)β-轉(zhuǎn)角(β-turn)無規(guī)則卷曲（randomcoil）超二級結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)以上二級結(jié)構(gòu)單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)的組合體如αα、βαβ、βββ。3.蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)——指多肽鏈上的所有原子（包括主鏈和側(cè)鏈）在三維空間的分布。肌紅蛋白4.蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)——多肽亞基（subunit）的空間排布和相互作用。亞基間以非共價(jià)鍵連接。血紅蛋白任何一個(gè)亞基接受氧分子后，會增進(jìn)其它亞基吸附氧分子的能力環(huán)境氧濃度高時(shí)Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧濃度低時(shí)Hb快速釋出氧分子動(dòng)脈靜脈血紅蛋白對氧的運(yùn)輸

α-角蛋白（毛發(fā)）主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成三股右手α-螺旋向左纏繞形成原纖維，原纖維排列成“9+2”的電纜式結(jié)構(gòu)稱微纖維，成百根微纖維結(jié)合成大纖微。

β-角蛋白（絲心蛋白）以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。片層結(jié)構(gòu)：反平行式β-折疊片以平行的方式堆積。鏈間主要以氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。共價(jià)鍵次級鍵化學(xué)鍵

肽鍵一級結(jié)構(gòu)氫鍵二硫鍵二、三、四級結(jié)構(gòu)疏水鍵鹽鍵范德華力三、四級結(jié)構(gòu)（三）蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級鍵肌紅蛋白是1957年由JohnKendrew用X射線晶體分析法測定的有三維結(jié)構(gòu)的第一個(gè)蛋白質(zhì)。它是典型的球形蛋白質(zhì)，高度折疊成緊密結(jié)構(gòu)，疏水氨基酸殘基大部分埋藏在分子內(nèi)部，極性殘基在表面。肌紅蛋白中有8條α-螺旋。由多肽的折疊形成的疏水空隙內(nèi)是血紅素輔基，通過肽鏈上的His殘基與肌紅蛋白分子內(nèi)部相連，它對肌紅蛋白的生物活性是必需的（與O2結(jié)合）。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定

概況:序列測定前的準(zhǔn)備工作：樣品的純度相對分子質(zhì)量肽鏈的數(shù)目氨基酸組成一級結(jié)構(gòu)的測定主要用小片段重疊的原理序列測定方法（1）末端分析：包括N端分析，C端分析N端分析方法①二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法）②丹磺酰氯法（DNS法）④氨肽酶（aminopeptidase,Apase）法AlaValGlyC端分析①硼氫化鋰還原法③羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法酶解方法4．指紋圖譜（fingerprint）法

PeptideFragmentationPeptidestendtofragmentalongthebackbone.FragmentscanalsolooseneutralchemicalgroupslikeNH3andH2O.H...-HN-CH-CO

...

NH-CH-CO-NH-CH-CO-…OHRi-1RiRi+1H+PrefixFragmentSuffixFragmentCollisionInducedDissociationMassSpectraGVDLKmass057Da=‘G’99Da=‘V’LKDVGThepeaksinthemassspectrum:PrefixFragmentswithneutrallosses(-H2O,-NH3)Noiseandmissingpeaks.andSuffixFragments.DH2OProteinIdentificationwithMS/MSGVDLKmass0Intensitymass0MS/MSPeptideIdentification:TandemMass-SpectrometryMassSpectrometryMatrix-AssistedLaserDesorption/Ionization(MALDI)FromlecturesbyVineetBafna(UCSD)TandemMassSpectrometryScan1708LCScan1707MSMS/MSIonSourceMS-1collisioncellMS-2DeNovovs.DatabaseSearchWRACVGEKDWLPTLTWRACVGEKDWLPTLTDeNovoAVGELTKDatabaseSearchDatabaseofallpeptides=20n

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MDERHILNM,KLQWVCSDL,PTYWASDL,ENQIKRSACVM,TLACHGGEM,NGALPQWRT,HLLERTKMNVV,GGPASSDA,GGLITGMQSD,MQPLMNWE,ALKIIMNVRT,AVGELTK,

HEWAILF,GHNLWAMNAC,GVFGSVLRA,EKLNKAATYIN..Mass,Score六、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子具有多樣的生物學(xué)功能，需要一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還需要一定的空間構(gòu)象。（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.種屬差異蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質(zhì)的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異，可以斷定它們在親緣關(guān)系上的遠(yuǎn)近。2.分子病——蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)的氨基酸排列順序與正常有所不同的遺傳病。鐮狀細(xì)胞貧血（sick-cellanemia）從患者紅細(xì)胞中鑒定出特異的鐮刀型或月牙型細(xì)胞。β-鏈1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑點(diǎn)含氧HbS脫氧HbS疏水位點(diǎn)血紅蛋白分子凝集★同源蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。

同源蛋白質(zhì)：在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。不同生物與人細(xì)胞色素C相比較的氨基酸差異數(shù)目表

生物名稱相差氨基酸數(shù)目生物名稱相差氨基酸數(shù)目黑猩猩0響尾蛇14恒河猴1海

龜15兔9金槍魚21袋

鼠10狗

魚23牛、羊、豬10小

蠅25狗11蛾31驢11小

麥35馬12粗糙鏈孢酶43雞、火雞13酵母菌44（二）蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系別（變）構(gòu)作用：含亞基的蛋白質(zhì)由于一個(gè)亞基的構(gòu)象改變而引起其余亞基和整個(gè)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生改變的作用。因別構(gòu)而產(chǎn)生的效應(yīng)稱別構(gòu)效應(yīng)。血紅蛋白是別構(gòu)蛋白，O2結(jié)合到一個(gè)亞基上以后，影響與其它亞基的相互作用。肌紅蛋白血紅蛋白在肺部O2的壓力在毛細(xì)血管中O2的壓力飽和度00.5120406080100120O2壓力24681012140.51.01.52.0OH-加入的當(dāng)量pHpK1pIpK2（3）（2）（1）Gly的滴定曲線OH-OH-+H3N—C—COOHHH（1）+H3N—C—COO-HH（2）H2N—C—COO-HH（3）Gly解離作用七、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的相對分子量蛋白質(zhì)相對分子量在10000~1000000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。最準(zhǔn)確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設(shè)計(jì)）：蛋白質(zhì)顆粒在25~50*104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。

s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s）

x=蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關(guān)系M=——————RTsD（1－Vρ）R——?dú)怏w常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對溫度D——擴(kuò)散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機(jī)轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計(jì)）V——蛋白質(zhì)的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系數(shù)蛋白質(zhì)的大小與形狀測分子量的方法：★化學(xué)組成法測定最低分子量★SDS法★凝膠過濾法★滲透壓法★擴(kuò)散系數(shù)法★沉降系數(shù)法和沉降平衡法（二）蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負(fù)電荷，在等電點(diǎn)pH時(shí)為兩性離子。電泳：帶電顆粒在電場中移動(dòng)的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率即異，在電泳時(shí)可以分開。1.自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。2.區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點(diǎn)在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。+—2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。-+等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場中不再移動(dòng)。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－（三）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)布郎運(yùn)動(dòng)、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）；

2）帶相同電荷。++++++（四）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1.加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。2.加有機(jī)溶劑3.加重金屬鹽4.加生物堿試劑單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。1.鹽析（saltingout）法

定義：高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出沉淀的方法原理：破壞水化膜、中和電荷特點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性分段鹽析：不同濃度的中性鹽分離不同蛋白質(zhì)2.有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)

原理：破壞水化膜條件：pH=pI特點(diǎn)：常在低溫下進(jìn)行常用有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮等3.重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)原理：中和負(fù)電荷條件：pH＞pI特點(diǎn)：蛋白質(zhì)變性4.生物堿試劑與某些酸類沉淀蛋白質(zhì)原理：中和正電荷條件：pH＜pI特點(diǎn)：蛋白質(zhì)變性常用酸類：苦味酸、鞣酸、鎢酸、三氯醋酸、硝酸、過氯酸等蛋白質(zhì)層析

（chromatography）定義：待分離的液體（流動(dòng)相mobilephase）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相solidphase)后所發(fā)生的各組分在兩相中分布的變化。原理：根據(jù)混合物溶液中蛋白質(zhì)分子的大小、形狀、極性、親和力等差異而加以分離。凝膠過濾分離蛋白質(zhì)westernblotting（蛋白印跡法，免疫印跡法）

把電泳分離的蛋白組分轉(zhuǎn)移到固定膜（如硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜）上的技術(shù)，稱為蛋白印跡（westernblotting）。

（五）蛋白質(zhì)的變性天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，其共價(jià)鍵不變，但分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性的空間排列發(fā)生變化，致使其原有性質(zhì)發(fā)生部分或全部喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性。變性蛋白質(zhì)主要標(biāo)志是生物學(xué)功能的喪失。溶解度降低，易形成沉淀析出，結(jié)晶能力喪失，分子形狀改變，肽鏈松散，反應(yīng)基團(tuán)增加，易被