染色質(zhì)免疫沉淀及其測序

染色質(zhì)免疫沉淀及其測序Chip-seq王雅琪染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第1頁目錄介紹技術(shù)原理技術(shù)流程應(yīng)用優(yōu)缺點(diǎn)測序染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第2頁一、介紹ChIP是當(dāng)前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用方法。不但能夠檢測體內(nèi)反式因子與DNA動態(tài)作用，還能夠用來研究組蛋白各種共價(jià)修飾與基因表示關(guān)系。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第3頁二、原理染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP）基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)，超聲波將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)染色質(zhì)小片段，然后用所研究目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性抗體免疫沉淀蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體，從而特異性地富集目標(biāo)蛋白結(jié)合DNA片段。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第4頁技術(shù)示意圖染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第5頁三、技術(shù)流程詳細(xì)操作流程染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第6頁1、甲醛交聯(lián)細(xì)胞詳細(xì)步驟染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第7頁2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10min。每1min顛倒搖動一次離心管。2.把DNA粉碎為長度200-1000bp，置于冰上。(不一樣本都進(jìn)行超聲條件優(yōu)化試驗(yàn))3.14000rpm離心10min(4℃)，轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第8頁3、免疫沉淀蛋白和DNA復(fù)合物染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第9頁4、收獲免疫復(fù)合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第10頁5、洗脫免疫復(fù)合物染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第11頁6、去除甲醛交聯(lián)解交聯(lián)：加入20ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M).混勻,65℃,解交聯(lián)過夜。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第12頁7、DNA純化1、酚-氯仿抽提2、硅膠柱純化染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第13頁8、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點(diǎn)判定1.假如目標(biāo)蛋白靶序列已知，或懷疑某一序列是目標(biāo)蛋白靶序列，則可選取定量或者半定量PCR方法。2.假如目標(biāo)蛋白靶序列未知或者研究目標(biāo)蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，則可采取ChIP克隆測序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第14頁四、應(yīng)用1.組蛋白修飾研究2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析3.藥品開發(fā)研究4.有絲分裂研究5.DNA損傷與凋亡分析染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第15頁五、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：充分反應(yīng)生理?xiàng)l件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用真實(shí)情況，能夠找出生理?xiàng)l件下某個(gè)DNA結(jié)合蛋白與DNA序列結(jié)合位點(diǎn)，從而反應(yīng)體內(nèi)基因表示調(diào)控真實(shí)情況。缺點(diǎn)：需要一個(gè)特異性蛋白質(zhì)抗體，有時(shí)難以取得；為了取得高等豐度結(jié)合片段，必須試驗(yàn)演示胞內(nèi)條件下靶標(biāo)蛋白質(zhì)表示情況；調(diào)控蛋白質(zhì)基因獲取可能需要限制在組織起源。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第16頁注意事項(xiàng)1、抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合有效性和特異性ChIP所選擇目標(biāo)蛋白抗體是ChIP試驗(yàn)成功關(guān)鍵。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí)，抗體抗原表位可能因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP結(jié)果。所以不是全部抗體都能做ChIP試驗(yàn)，只有經(jīng)過ChIP試驗(yàn)驗(yàn)證后抗體才能確保試驗(yàn)結(jié)果可靠性。假如目標(biāo)蛋白沒有商品化適合用于染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)抗體，只有其它用途抗體時(shí)，能夠先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測。假如抗體能夠成功沉淀蛋白，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)檢測。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第17頁2、交聯(lián)條件交聯(lián)所用甲醛終濃度約為1%，而交聯(lián)時(shí)間需要預(yù)試驗(yàn)來確定。通常交聯(lián)條件為室溫10min。甲醛交聯(lián)反應(yīng)可被加入甘氨酸終止。交聯(lián)時(shí)間假如過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且試驗(yàn)材料也輕易在離心過程中丟失。交聯(lián)時(shí)間假如過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第18頁3、超聲片段大小打斷后染色質(zhì)片段長度應(yīng)主要集中在200-1000bp左右。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第19頁六、測序ChIP-Seq原理是：首先經(jīng)過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目標(biāo)蛋白結(jié)合DNA片段，并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到DNA片段進(jìn)行高通量測序。研究人員經(jīng)過將取得數(shù)百萬條序列標(biāo)簽準(zhǔn)確定位到基因組上，從而取得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作DNA區(qū)段信息。染色質(zhì)免疫沉淀及其測序第20頁應(yīng)用領(lǐng)域（1）判斷DNA鏈某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾；（2）檢測RNAp