抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座

抗生素概述鏈霉素發(fā)酵生產工藝（略）青霉素發(fā)酵生產工藝1232023/4/261抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第1頁抗生素分類2

抗生素化學結構3

抗生素生產技術需求4抗生素定義與命名12023/4/262抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第2頁早期定義當代定義抗生素是一個微生物產生，能抑制或干擾其它微生物生長，甚至殺死它種微生物一個化學物質?？股厥俏⑸?、植物和動物產生（或化學合成取得），能夠在低微濃度下有選擇地抑制或殺滅它種生物有機物質。2023/4/263抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第3頁依據(jù)化學結構和性質。如，含有四環(huán)素結構一類化學物質為四環(huán)素類抗生素。依據(jù)起源生物屬名。如，起源于青霉菌抗生素為青霉素；以一些習慣性俗名、發(fā)覺地名等命名。如，正定霉素、井岡霉素、金霉素和土霉素等；命名標準2023/4/264抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第4頁抗生素分類2

抗生素化學結構3

抗生素生產技術需求4抗生素定義與命名12023/4/265抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第5頁生物起源作用機理作用對象類別放線菌：鏈霉菌抗生素舉例真菌：青霉菌細菌：多黏桿菌鏈霉菌青霉菌多粘菌素抑制細胞壁合成影響細胞膜功效抑制蛋白質合成青霉素多烯類抗生素四環(huán)素廣譜抗菌抗革蘭陽性菌抗真菌氨芐青霉素青霉素放線菌酮2023/4/266抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第6頁生物合成路徑應用領域生產工藝類別氨基酸或肽類衍生物抗生素舉例糖苷類衍生物乙酸或丙酸衍生物青霉素，環(huán)絲氨酸鏈霉素，紅霉素四環(huán)素，灰黃霉素人用抗生素農用抗生素食品保藏、物品防腐和霉變頭孢霉素，羧芐青霉素井岡霉素，春雷霉素金霉素，放線菌酮微生物發(fā)酵（生物合成）化學全合成半合成青霉素，鏈霉素氯霉素，磷霉素氨芐青霉素，頭孢菌素2023/4/267抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第7頁抗生素分類2

抗生素化學結構3

抗生素生產技術需求4抗生素定義與命名12023/4/268抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第8頁分為9類，化學結構決定了理化性質、作用機制及其療效2023/4/269抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第9頁抗生素分類2

抗生素化學結構3

抗生素生產技術需求4抗生素定義與命名12023/4/2610抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第10頁即生物合成路徑，當前大多數(shù)抗生素品種采取發(fā)酵生產工藝，其特點是成本較低，周期較長結構相對簡單抗生素可采取此路徑如氯霉素和磷霉素利用化學方法修飾改良生物合成抗生素，擴大抗菌譜提升療效和降低毒副作用等，取得新抗生素，如半合成青霉素、半合成頭孢菌素等工業(yè)化生產路徑微生物發(fā)酵化學全合成化學半合成2023/4/2611抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第11頁微生物合成抗生素上游：菌種保留、選育、孢子及種子制備發(fā)酵——適宜培養(yǎng)基、碳源、氮源、無機鹽（微量元素）、前體、消沫劑；流加碳源和氮源、流加氨水調整PH、好氧培養(yǎng):通入無菌氧氣

下游：提取

預處理過濾深入提取（萃取、離子交換、沉淀法、吸附法等）結晶干燥純品2023/4/2612抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第12頁

抗生素概述鏈霉素發(fā)酵生產工藝（略）青霉素發(fā)酵生產工藝1232023/4/2613抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第13頁1青霉素研究2青霉素生產菌特征3青霉素發(fā)酵工藝過程4青霉菌分離純化工藝過程2023/4/2614抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第14頁主要作用于細胞壁肽多糖合成第三階段。線性肽多糖在轉肽酶催化下進行交聯(lián)，肽多糖鏈之間每兩條肽鏈結合時均釋放出一個D-丙氨酸。青霉素與肽多糖D-丙胺酰-D-丙氨酸二肽相同，競爭性與轉肽酶結合，是轉肽酶不能催化多肽鏈之間交聯(lián)，從而起到抑菌作用。所以，青霉素對生長中細胞有效，對靜止細胞無效。是發(fā)覺最早、最卓越一個β-內酰胺類抗生素，其內酰胺環(huán)是主要抗菌活性結構。青霉素是抗生素工業(yè)首要產品，中國為青霉素生產大國，青霉素產量已占世界產量近70%。作用機理青霉素2023/4/2615抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第15頁（1）臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和一些革蘭氏陰性細菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。（2）各種半合成抗生素原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素頭孢菌素母核。2023/4/2616抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第16頁青霉素可看成是6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic6APA）苯乙酰衍生物。側鏈基團不一樣，形成不一樣青霉素。其中主要是青霉素G。分子結構及其衍生物2023/4/2617抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第17頁側鏈取代基R化學名稱通用名稱HO-C6H4-CH2-對羥基芐青霉素青霉素XC6H5-CH2-芐基青霉素青霉素GCH3-CH2-CH=CH-CH-2-戊烯基青霉素青霉素FCH3-(CH2)3-CH2-戊青霉素青霉素FCH3-(CH2)5-CH2-庚青霉素青霉素KCH2=CH-CH2-S-CH2-丙烯巰甲基青霉素青霉素OC6H5O-CH2-苯氧甲基青霉素青霉素V2023/4/2618抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第18頁青霉素是有機酸，易溶于醇、酸、醚、酯類。青霉素在水中溶解度很小，而且很快失去活性。青霉素GpK值為2.76，能與無機或有機堿成鹽。青霉素鹽極易溶于水，幾乎不溶于乙醚、氯仿、乙酸戊酯等，易溶于低級醇，略溶于乙醇、丁醇、乙酸乙酯等，而水存在會加速溶解。青霉素鹽穩(wěn)定性與含水量和純度相關，干燥純品很穩(wěn)定，對熱也很穩(wěn)定，可進行干熱滅菌。但在水中很不穩(wěn)定，隨溫度和PH影響很大，低溫下穩(wěn)定，而高溫下易失活。普通在PH5~7時較穩(wěn)定，PH在6~6.5最穩(wěn)定。青霉素遇酸、堿和金屬離子都很不穩(wěn)定，發(fā)生開環(huán)、重排和降解等反應，內酯胺環(huán)破壞后，青霉素失去活性。青霉素G類鹽理化性質交表（書P172）2023/4/2619抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第19頁1青霉素研究2青霉素生產菌特征3青霉素發(fā)酵工藝過程4青霉菌分離純化工藝過程2023/4/2620抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第20頁青霉素生產菌特征生物學特征：產黃青霉按孢子形態(tài)分為：綠色孢子和黃色孢子深層培養(yǎng)菌絲形態(tài)：球狀和絲狀兩種生產上采取綠色絲狀菌株菌落：平坦或皺褶，圓形青霉穗:分生孢子，排列呈鏈狀，似毛筆2023/4/2621抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第21頁發(fā)酵條件下生長過程第1期：分生孢子萌發(fā)，含有小泡。第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：脂肪包涵體，儲備物，嗜堿性很強。第4期：空泡，嗜堿性減弱，開始產生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪體消失，青霉素產量最高。第6期：個別細胞自溶，胞內無顆粒，釋放氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。2023/4/2622抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第22頁在規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期形態(tài)改變，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長久，3期菌體為適宜種子。4－5期為生產期，生產能力最強，經過工藝辦法，延長此期，取得高產。第6期到來之前結束發(fā)酵。發(fā)酵條件下生長過程2023/4/2623抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第23頁1青霉素研究2青霉素生產菌特征3青霉素發(fā)酵工藝過程4青霉菌分離純化工藝過程2023/4/2624抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第24頁瓊脂斜面米孢子種子罐發(fā)酵罐過濾萃取脫色結晶干燥冷凍干燥孢子工業(yè)鹽成品青霉素生產工藝流程2023/4/2625抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第25頁發(fā)酵工藝過程1、生產孢子制備斜面孢子：將砂土保藏孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成斜面固體培養(yǎng)基活化再傳斜面進行培養(yǎng)米孢子：接入到優(yōu)質小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天（25℃，相對濕度50%）注意：每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。2023/4/2626抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第26頁2、種子罐培養(yǎng)工藝一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等。pH自然，空氣流量1：3（體積比）；300-350r/min；溫度（27±1）℃,40-50h,菌絲濃度達40%以上。二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿等。pH自然，空氣流量：1:（1-1.5）；250-280r/min；（25±1）℃。14h，菌絲濃度40%以上，殘?zhí)?.0%左右，無雜菌，為合格種子。2023/4/2627抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第27頁3、生產罐培養(yǎng)工藝三級罐：生產罐；接種量12%-15％培養(yǎng)基：花生餅粉（高溫），麩質粉，玉米漿，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫酸鈉，硫代硫酸鈉，磷酸二氫鈉，苯乙酰胺及消沫劑，CaCO3等參數(shù)條件：

通氣量：0.7-1.8；150-200r/min；

前60小時:pH5.7-6.3，26℃；

60小時后:pH6.3-6.6,24℃。2023/4/2628抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第28頁操作方式：重復分批式發(fā)酵發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3.帶放:6-10次，間隔24h，帶放量10％。發(fā)酵時間：204h前40小時：培養(yǎng)基中主要營養(yǎng)物40小時后：低速連續(xù)流加葡萄糖、氮源等，使菌半饑餓，延長合成期，提升產量。發(fā)酵過程控制2023/4/2629抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第29頁

碳源選擇碳源占成本12％以上，采取糖化液流加,降低成本。糖與6APA(6-氨基青霉烷)結合形成糖基-6APA，影響青霉素產量。依據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量控制糖流加。葡萄糖流加，波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停頓，過高則造成呼吸活性下降，甚至引發(fā)自溶。殘?zhí)窃?.6％左右，pH開始升高時流加糖。（一）培養(yǎng)基2023/4/2630抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第30頁氮源選擇玉米漿:最好，含有各種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補加無機氮源：硫酸銨、氨水、尿素補氮。無機鹽無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵有毒，控制在30ug/ml以下。2023/4/2631抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第31頁添加前體時期：合成階段種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等毒性：抑制細胞生長和青霉素合成。策略：低濃度流加控制：保持供給速率略大于生物合成需要。2023/4/2632抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第32頁青霉菌生長適宜溫度30℃，合成適宜溫度25℃20℃，青霉素破壞少，但周期很長變溫控制，不一樣階段不一樣溫度生長階段：較高溫度，縮短生長時間生產階段：適當降低溫度，以利于青霉素合成前期控制在25-26℃左右，后期降溫控制24℃（二）溫度2023/4/2633抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第33頁合成適宜pH6.4－6.6左右，防止超出7.0在堿性條件下不穩(wěn)定，易水解pH下降：流加CaCO3、通氨水調整或提升通氣量pH上升：流加糖或天然油脂（三）PH2023/4/2634抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第34頁＜30％飽和氧濃度，產率急劇下降＜10％飽和氧濃度，造成不可逆損害臨界溶氧濃度：30％通氣比：1：0.8VVM適宜攪拌速度，確保氣液混合，提升溶氧依據(jù)各階段生長和耗氧量不一樣，調整攪拌轉速:（四）溶解氧2023/4/2635抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第35頁臨界菌體濃度：溶解氧速率和氧消耗速率到達平衡時菌體濃度。>此濃度，則供氧不足，溶解氧下降，發(fā)酵產率下降。發(fā)酵穩(wěn)定時，濕菌濃15%-20%,菌干重3%-5%左右（五）菌體濃度2023/4/2636抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第36頁天然油脂：玉米油化學消沫劑：泡敵策略：少許多次注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。（六）消沫2023/4/2637抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第37頁1青霉素研究2青霉素生產菌特征3青霉素發(fā)酵工藝過程4青霉菌分離純化工藝過程2023/4/2638抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第38頁分離純化工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產物含有致敏性

在發(fā)酵液預處理、提取和精制過程條件溫和、快速，預防降解。2023/4/2639抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第39頁青霉素分離純化工藝過程預處理過濾萃取脫色結晶2023/4/2640抗生素發(fā)酵生產工藝專家講座第40頁青霉素存在部位：發(fā)酵液濃度較低：僅含百分之幾含有大量雜質：菌體細胞、核酸、雜蛋白質、細胞壁多糖等、殘留培養(yǎng)基、色素、金屬離子、代謝產物等目標：濃縮青霉素，去除大部分雜質，改變發(fā)酵液流變學特征，便于后續(xù)分離純化過程預處理:發(fā)酵液加少許絮凝劑沉淀蛋白（1）預處理2023/4/2641抗生素發(fā)酵生產工藝專家