基于石墨烯薄膜修飾電極的酶催化系統(tǒng)對,4二氯苯酚的檢測

1摘要

制備了用于檢測2,4-二氯苯酚的含有氧化物酶（HRP)和石墨烯的新的生物傳感器，在過氧化氫的存在條件下，2,4-二氯苯酚在酶氧化過程中形成的自由基在電極上發(fā)生了電化學(xué)反應(yīng)后被還原。2,4-DCP的還原產(chǎn)物均勻地分布在溶液中?？疾炝薍RP濃度，pH，電勢，H2O2濃度等對生物傳感器的性能影響。在最佳優(yōu)化條件下，這種用于檢測2,4-DCP的改進(jìn)的生物傳感器在1.0×10-8M到1.3×10-5M范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，檢出限下降到5.0×10-9M（S/N=3)。與之前報道過的2,4-DCP傳感器相比，這種改進(jìn)的生物傳感器表現(xiàn)出了更寬的線性范圍和低的檢出限，同時，它也具有良好的重現(xiàn)性和長久的穩(wěn)定性。目前一頁\總數(shù)二十二頁\編于八點21引言

2,4-DCP是一個重要的中間物，來制造一些常用的含苯氧基除草劑,制藥、殺真菌劑,和殺蟲劑。然而,其高毒性、強(qiáng)烈氣味、不易降解，疑似致癌、致突變的屬性意味著2,4-DCP作為一個環(huán)境污染物帶來了嚴(yán)重的生態(tài)問題。高度危險和有毒特征的2,4-DCP需要簡單,快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法,并將其量化。本文提出了一些方法如高效液相色譜法、氣相色譜法,分光光度法，化學(xué)發(fā)光法。然而這些方法要么是不方便,不穩(wěn)定,昂貴的或是操作復(fù)雜。他們也不能用于體內(nèi)和就地檢測。在過去的一年里，電化學(xué)方法已經(jīng)得到廣泛的重視，由于其巨大的優(yōu)勢,例如簡單的操作、快速響應(yīng)、良好的靈敏度、低成本和現(xiàn)場檢測。一些關(guān)于通過電化學(xué)方法檢測2,4-DCP已經(jīng)出現(xiàn)。然而,通常需要高的氧化電勢(700-900mV)，在這個情況下，就會導(dǎo)致來自一些共存化合物的嚴(yán)重的干擾因素。2,4-DCP的電極氧化產(chǎn)物也會在電極上積累，產(chǎn)生積垢。目前二頁\總數(shù)二十二頁\編于八點

最近,基于酶反應(yīng)的電化學(xué)傳感器在痕量分析上顯示競爭優(yōu)勢，因為其高的放大效應(yīng)和對酶的選擇性高。大量的測定酚化合物的生物傳感器被廣泛報道。在大多數(shù)的這些實驗中,已經(jīng)進(jìn)行了很多嘗試來提高靈敏度和通過酶固定在不同的材料來提高穩(wěn)定性。石墨烯因為它的獨特的物理化學(xué)性質(zhì)吸引了國際關(guān)注，如高表面積,高電荷傳輸流動性,好的電催化活性和強(qiáng)大的機(jī)械強(qiáng)度。石墨烯的這些特性，特別是便于酶組裝可以用來制造電化學(xué)生物傳感器。最近,一些研究者發(fā)現(xiàn)石墨烯對苯酚也有良好的吸收能力，這將有利于酚類化合物在電極上的富集。考慮到高的導(dǎo)電率、高固定化酶能力和對苯酚強(qiáng)的吸附性能,石墨烯應(yīng)該是一個好的制備2,4-DCP生物傳感器材料。目前三頁\總數(shù)二十二頁\編于八點42實驗部分2.1儀器和試劑

石墨、聯(lián)氨溶液(50wt%),氨溶液(28wt%)和2,4-DCP的分析級。拉曼光譜，石墨,石墨烯氧化物。透射電子顯微鏡(TEM)，掃描電子顯微鏡(SEM)，發(fā)射掃描電子顯微鏡（ESEM），電化學(xué)分析儀,常規(guī)的三電極體系，用鉑箔作為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。工作電極為裸露或修飾的玻碳電極（GCE)目前四頁\總數(shù)二十二頁\編于八點2.2石墨烯的制備

石墨稀氧化物是由天然石墨粉通過一種改進(jìn)的電化學(xué)方法制得的。通常,通過超聲波法，將石墨烯氧化物溶解在水中可以形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的分散液。然后將獲得的棕色分散液在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心分離30分鐘后移除沒有溶解的石墨氧化物。然后將均勻的石墨烯氧化物分散液(5.0毫升)在50攝氏度下攪拌12h。冷卻到室溫后，在制得的分散液中加入3.5微升肼溶液和40.0微升的氨溶液。在充分?jǐn)嚢韬驼袷帋追昼姾?將瓶子油浴(95℃)1h以獲得穩(wěn)定的黑色分散液。將分散液通過尼龍膜過濾(0.22微米)來獲得石墨烯。目前五頁\總數(shù)二十二頁\編于八點2.3基于石墨烯2,4-DCP生物傳感器的制備

基于石墨烯的傳感器的制備過程如下：將2毫克石墨烯加入到1毫升的1.0%（W/V）的殼聚糖水溶液中，通過超聲破碎法形成均勻的分散液。將50微升的HRP加入到50微升質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2mg/mL的石墨烯殼聚糖水性懸浮液中，為了吸附HRP，將此混合溶液在室溫下充分振蕩30分鐘。經(jīng)過吸附過程，通過注射器，將5微升上述的混合液分散到預(yù)處理過的玻碳電極表面。將電極在4℃下自然晾干，如果不用的話，將修飾電極儲存在4℃。目前六頁\總數(shù)二十二頁\編于八點2.42,4-DCP的檢測2,4-DCP的測定是在室溫下在含有H2O2的0.1MpH為7.0的PBS溶液中進(jìn)行的。對于電流的檢測，所以的測量值都是在運用一個最適當(dāng)?shù)碾妱荩ㄏ啾雀使姌O而言）加到工作電極上，并在加入2,4-DCP以后，相比較未加入的電勢，電勢基流會衰減到更穩(wěn)定的狀態(tài)。在加入了2,4-DCP以后，我們對電流峰值變化做了記錄。在所以的極普法測量中，要通過充分?jǐn)嚢枞芤簛慝@得對流運輸。目前七頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.1石墨烯的特性描述3.2基于石墨烯的生物傳感器對檢測2,4-DCP的可行性研究3.3檢測的優(yōu)化3結(jié)果與討論8目前八頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.1石墨烯的特性描述9

一系列用于表面探測的測量,如拉曼光譜，透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM),來描述獲得的石墨烯的特征。拉曼光譜被用來反映從原始的石墨到石墨烯氧化物然后到還原石墨烯的結(jié)構(gòu)變化(圖1A)。在拉曼光譜的原始石墨顯示一個突出的G峰在1580cm-1，對應(yīng)這個一階散射的E2g態(tài)(圖1A-a)。在拉曼光譜的石墨烯氧化物(圖1A-b),G帶擴(kuò)大,和D帶在1350cm-1變得突出,還原在sp2域占主要地位，可能是由于大量的氧化。石墨烯的拉曼光譜還包含G和D帶,然而,D/G強(qiáng)度相比石墨烯氧化物增加(圖1A-c)。這一變化顯示在sp2域內(nèi)還原脫落石墨烯氧化物減少。圖1B顯示了石墨烯納米片的TEM圖片。清楚地說明了片狀的形狀。圖C和D是SEM圖像的石墨烯和石墨烯殼聚糖復(fù)合材料沉積在GCE表面圖。目前九頁\總數(shù)二十二頁\編于八點圖1（A）拉曼光譜對散裝石墨（a）石墨烯氧化物（b）和石墨烯（c）；(B)石墨烯的TEM圖片；(C)石墨烯的SEM圖片;(D)石墨烯殼聚糖復(fù)合物的SEM圖片。目前十頁\總數(shù)二十二頁\編于八點圖2石墨烯殼聚糖溶液的照片(A)和石墨烯水溶液照片（B）目前十一頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.2基于石墨烯檢測2,4-DCP的生物傳感器的可行性研究HRP+H2O2→Compound-I+H2O(1a)Compound-I+Cl2C6H3OH→Compound-II+Cl2C6H3O*(1b)Compound-II+Cl2C6H3OH→HRP+Cl2C6H3O*+H2O(1c)Cl2C6H3O*+e-+H+→Cl2C6H3OH(1d)12目前十二頁\總數(shù)二十二頁\編于八點方案1使用HRP/石墨烯修飾玻碳電極檢測2,4-DCP的示意圖目前十三頁\總數(shù)二十二頁\編于八點圖3（A）HRP/石墨烯生物傳感器在不同溶液中的循環(huán)伏安圖圖3（B）HRP/石墨烯生物傳感器在不同溶液中的安培電流圖目前十四頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.3檢測條件的優(yōu)化HRP濃度的影響底液pH值的影響電極電勢的影響過氧化氫濃度的影響目前十五頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.3.1HRP濃度的影響圖4EffectofHRPconcentrationonthebiosensorresponseto1.0uM2,4-DCPin0.1MpH7.0PBScontaining100.0uMH2O2at0.25V(vs.SCE).目前十六頁\總數(shù)二十二頁\編于八點

3.3.2pH的影響

圖5EffectofpHofPBSonthebiosensorresponseto1.0uM2,4-DCPin0.1MPBScontaining100.0uMH2O2at0.25V(vs.SCE).目前十七頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.3.3電極電勢的影響圖6

Effectofappliedpotential(vs.SCE)onthebiosensorresponseto1.0mM2,4-DCPin0.1MpH7.0PBScontaining100.0mMH2O2.目前十八頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.3.4過氧化氫濃度的影響

圖7Calibrationcurvesfor2,4-DCPdeterminationwithHRP/graphenesensorinthepresenceof(A)10.0,(B)50.0,(C)100.0and(D)200.0uMof

H2O2inpH7.0PBS.Appliedpotential:-0.25Vvs.SCE.InsetwasthedependenceofthesensitivityoftheHRP/graphenebiosensoronH2O2concentration(S,sensitivity).目前十九頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.4HRP/石墨烯生物傳感器性能特點圖8AmperometricresponseoftheHRP/GCE(A),andHRP/graphene/GCE(B),onsuccessiveadditionof2,4-DCPinto0.1MpH7.0PBScontaining100.0mMH2O2at-0.25V(vs.SCE).Inset:CalibrationcurvesoftheHRP/GCE(A),andHRP/graphene/GCE(B),for2,4-DCP.目前二十頁\總數(shù)二十二頁\編于八點3.5生物傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

固定酶的一個原因是提高壽命,允許使用很長一段時間。因此,評估生物傳感器的壽命是在一個月內(nèi)通過測量其對1.0uM2,4-DCP的響應(yīng)。兩周后，生物傳感器在電流響應(yīng)上沒有明顯的降低。考慮到這種生物傳感器便宜和制備簡單。這個范圍時間可以是可接受的。使用相同的電極，在檢測1.0uM2,4-DCP10次來獲得測量的重現(xiàn)性。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是4.3%。HRP/石墨烯生物傳感器的重現(xiàn)性是通過10種不同時間制造的生物傳感器來評估的。這