華中科技大學(xué)發(fā)酵工程 第二章 工業(yè)用微生物菌種

發(fā)酵工程FermentationEngineering精品課程華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院第二章發(fā)酵工業(yè)菌種/jpkc本章內(nèi)容

一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術(shù)三、發(fā)酵工業(yè)菌種改良/jpkc對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行菌種篩選時(shí)，有兩條經(jīng)驗(yàn)：進(jìn)化上向上兼容；次生代謝在進(jìn)化上后移，芽孢菌以上才有篩選意義。/jpkc最常用的工業(yè)微生物細(xì)菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌/jpkc最常用的工業(yè)微生物酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬/jpkc最常用的工業(yè)微生物霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點(diǎn)青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉/jpkc最常用的工業(yè)微生物放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動(dòng)放線菌/jpkc未培養(yǎng)微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。研究方法模擬自然培養(yǎng)法:原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細(xì)胞操作宏基因組分析法/jpkc二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選原則與基本技術(shù)（一）發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢(shì)與要求（二）分離篩選原理與技術(shù)（三）應(yīng)用舉例/jpkc

1.菌種選擇的總趨勢(shì)野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

/jpkc

2.菌種選擇的要求

能在廉價(jià)原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；

生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；培養(yǎng)條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強(qiáng)；/jpkc2.菌種選擇的要求（續(xù)）菌種不易變異退化；對(duì)放大設(shè)備的適應(yīng)性強(qiáng)；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。/jpkc（二）分離篩選原理與技術(shù)1.篩選的指導(dǎo)思想2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面3.

新種分離篩選原理與技術(shù)/jpkc1.篩選的兩種指導(dǎo)思想

先分離純化，再結(jié)合工藝要求進(jìn)行篩選。分離純化同時(shí)富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株

/jpkc2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。從保藏機(jī)構(gòu)獲取菌種進(jìn)行分離篩選有兩個(gè)好處：經(jīng)濟(jì)性指導(dǎo)性/jpkc設(shè)計(jì)篩選方案時(shí)必須考慮兩個(gè)要點(diǎn)

選擇性靈敏度

/jpkc3.新種分離與篩選的步驟

調(diào)查研究（包括資料查閱）

試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

含微生物樣品的采集（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預(yù)處理（如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)）

菌種分離

/jpkc

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點(diǎn)分

選擇性分離方法 隨機(jī)分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復(fù)篩

/jpkc

菌種純化初步工藝條件摸索再復(fù)篩生產(chǎn)性能測(cè)試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗(yàn)?zāi)承┍匾囼?yàn)和或作為育種的出發(fā)菌株毒性試驗(yàn)等

/jpkc含微生繁物樣品坐的采集采樣時(shí)剃應(yīng)注意俱的問題塞:土壤微生壯物的分布采土深彩度土壤植昨被情況采樣季薦節(jié)土壤的酸潔堿度對(duì)于分離災(zāi)篩選新菌悲種，還存妨在另兩個(gè)持選擇標(biāo)準(zhǔn)魂：土壤來君源廣泛在已適應(yīng)冊(cè)相當(dāng)苛刻葉環(huán)境壓力后的微生物住類群中尋旅找新菌種/jpkc樣品的墻預(yù)處理目的：提擦高分離效管率方法：物理方法外：熱處理唐；膜過濾純法；離心雅法化學(xué)方層法誘餌法/jpkc分離方法樣的選擇根據(jù)目撕的菌有短無選擇陽性特征渣來選擇歪分離方疾法菌種的營槍養(yǎng)特征獨(dú)鞠特生長特征德獨(dú)特?zé)o選擇性漿特征賤根憑據(jù)產(chǎn)物述的特征豬進(jìn)行隨機(jī)分離選擇性循分離的算關(guān)鍵：犁生長培等養(yǎng)條件爆的選擇賤與控制殊，從而項(xiàng)實(shí)現(xiàn)定鐵向富集義篩選。選擇性分雜離/jpkc選擇性分違離原理和蔥技術(shù)生長條鬧件的選鐘擇與控爹制原理控制營養(yǎng)淹成分控制培厭養(yǎng)基酸紋堿度添加抑煩制劑控制培錯(cuò)養(yǎng)溫度控制通氣悉條件選擇性敵分離技偏術(shù)富集液吹體培養(yǎng)堆技術(shù)固體培養(yǎng)卷技術(shù)施加選件擇壓力姓，進(jìn)行鋒定向篩釣選/jpkcA.富集話液體培養(yǎng)增加混樓合菌群兇中所需械菌株數(shù)乳量的一梳種技術(shù)技術(shù)特正點(diǎn)：給回混合菌危群提供盈一些有灶利于目吧的菌株幸生長或澡不利于疾目的菌避以外的曾其他菌品型生長領(lǐng)的條件培養(yǎng)方隆式分批培計(jì)養(yǎng)方式踢：以最罩大比生走長速率抄（μmax）篩選，范存在選擇批壓力的控裁制、移種米時(shí)間和次志數(shù)等問題連續(xù)培漠養(yǎng)方式拌：以比鹿生長速棄率（賓μ）篩投選/jpkcμABS0基質(zhì)濃度習(xí)對(duì)A、B憑兩種菌的升比生長速爛率（μ）按的影響當(dāng)S<S0時(shí)，富集門什么菌株私？當(dāng)S>S0時(shí)，富集蠅什么菌株蹄？/jpkc連續(xù)富集證培養(yǎng)技術(shù)刊分離菌株崇的優(yōu)點(diǎn)分離的媽菌株特旗別適合留連續(xù)發(fā)代酵生產(chǎn)冶過程有利于逆分離具治有某種疤工業(yè)生縮慧產(chǎn)特性墾的菌株可以篩選逗出能共生閘的穩(wěn)定混餐合培養(yǎng)物/jpkcB.固體培之養(yǎng)技術(shù)常用于分浪離某些酶業(yè)產(chǎn)生菌選擇壓力乞：在選擇嫌培養(yǎng)基中斗加入所需屬酶的基質(zhì)/jpkc隨機(jī)分離旱原理與技江術(shù)從產(chǎn)物入頑手，通過階設(shè)計(jì)高產(chǎn)培養(yǎng)姿基和建立編快速靈訂敏專一解的篩選績方法，業(yè)從隨機(jī)姻分離的遇菌落中屈篩選出孤所需的射目的菌虎。技術(shù)關(guān)鍵：絨產(chǎn)物合適成條件最的選擇仙與控制董及相應(yīng)攀篩選方睜法的確塵定。隨機(jī)分堆離技術(shù)婆舉例抗生素喇產(chǎn)生菌麻的篩選藥理活性多化合物產(chǎn)暈生菌的篩藏選生長因言子產(chǎn)生挑菌的篩撒選多糖產(chǎn)殿生菌的橋篩選/jpkc高產(chǎn)培養(yǎng)被基設(shè)計(jì)的遷幾個(gè)原則制備一系還列的培養(yǎng)剖基，其中繳有各種類息型的養(yǎng)分缸成為生長例限制因素觀；使用一聚盯合或復(fù)合素形式的生悟長限制養(yǎng)芹分；避免使用背容易同化鄰的碳源或搬氮源，防勵(lì)止分解代雁謝物阻遏丘；確定含有波所需的輔斯因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以革減少pH變化；前體、促次進(jìn)劑及抑類制劑的采邁用。/jpkc抗生素貢產(chǎn)生菌森的篩選篩選模型諷：試驗(yàn)菌篩選方匙法：鋪菌法復(fù)印平板覺法液體培養(yǎng)抹篩選抗藥性篩選篩選模帝型：氨芐青霉脅素和β-內(nèi)是酰胺酶產(chǎn)生菌胖（克雷攪白氏菌隊(duì)）協(xié)同I熟II無試樣時(shí)闊（不含棒近酸時(shí)），喇I對(duì)II煙菌作用不候大有試樣投時(shí)（含槽棒酸時(shí)掩），I群對(duì)II寨菌恢復(fù)悔藥效，像棒酸抑亞制水解影酶活性固體培麻養(yǎng)篩選/jpkc試驗(yàn)菌爐代表微蒼生物類爺型金黃色葡籃萄球菌209p須革蘭氏司陽性球菌枯草桿菌卷6633內(nèi)革歸蘭氏陽性館桿菌大腸桿菌麥革蘭氏阻陰性腸道亦細(xì)菌恥垢分別枝桿菌遞607結(jié)核桿董菌白色念澡珠菌正酵母再狀真菌青霉菌絲狀真菌/jpkc藥理活性觸化合物產(chǎn)倉生菌的篩補(bǔ)選藥理活舊性化合裹物是指耳能抑制宜人類代湖謝中某迷一個(gè)關(guān)基鍵酶的步微生物娘產(chǎn)物即槐酶抑制界劑，從趟而達(dá)到辣治療的應(yīng)目的。篩選模型忠：目標(biāo)酶/jpkc生長因械子產(chǎn)生姐菌的篩剖選篩選模型夕：營養(yǎng)缺輛陷型試驗(yàn)免菌篩選方法草：利用被益分離的微妻生物產(chǎn)物靈能否促進(jìn)徹營養(yǎng)缺陷煩型試驗(yàn)菌帝生長/jpkc氨基酸產(chǎn)雖生菌的篩框選樣品預(yù)處理初篩（除身真菌）在分離聞平板上賺生長獲敗得多個(gè)蜜單菌落復(fù)印平慶板（cop管y法糧）平板培節(jié)養(yǎng)，其帳中有產(chǎn)呆生氨基促酸的菌落架分泌氨斗基酸對(duì)應(yīng)到炕cop堂y前相役應(yīng)u.v增線殺死祖長好的足菌落位置，找元到目的菌深落再鋪上番一層含觸營養(yǎng)缺柜陷型試?yán)躜?yàn)菌的鴿瓊脂培養(yǎng)后產(chǎn)氨基日酸菌落篇周圍有姜生長圈目的菌羅落進(jìn)行子液體培揚(yáng)養(yǎng)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)敵行定量測(cè)拾定篩選產(chǎn)物的含量高的冬菌株多糖產(chǎn)生爐菌的篩選取樣特點(diǎn)登：碳水化租合物工業(yè)盜的廢棄物篩選方案肅：從菌落灰外觀判斷旦，選擇外訂觀呈粘液質(zhì)狀的菌落伍，然后根報(bào)據(jù)液體培詞養(yǎng)測(cè)定多眾糖含量來趴篩選高產(chǎn)貢菌。/jpkc細(xì)菌分鍬離：以蛾乳酸菌星為例取未成熟克的醬醪樣憶品1g至無保菌磨口瓶掉中加麥芽汁單至瓶口處幫，封塞，揀25℃培申養(yǎng)24-翁48h培養(yǎng)基中斗長出絹絲骨狀波動(dòng)物盒，鏡檢翼?xiàng)U狀，陽談性染色晴初步構(gòu)斷定乳酸羽菌用選擇性立培養(yǎng)基分伸批富集培摘養(yǎng)2-3代稀釋分離屆法分離單掙菌落，培目養(yǎng)基為含箱麥芽汁、CaC肺O3的瓊脂減培養(yǎng)基根據(jù)透嚼明圈挑臣選菌落性能測(cè)倚定（鏡惱檢桿狀鏟，染色脫陽性；誰乳酸紙苦層析鑒你定）Rf值定性（有機(jī)酸編呈黃斑點(diǎn)魚）乳酸生成竿量測(cè)定（隸滴定法）/jpkc放線菌的諷分離：劇以產(chǎn)鏈霉慮素菌種的主分離為例眉（從退鞏化菌種中父篩選）取工業(yè)發(fā)解酵液（含君孢子）樣鳥品1環(huán)放入帶備玻璃珠掉的裝有10m港l無菌水的距小三角瓶欲中，搖勻采用稀釋弟法制平板漠，獲取單音菌落斜面保醬藏去高產(chǎn)菌營恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)曲菌的特點(diǎn)頭，選擇目座的菌落放大培養(yǎng)讀，發(fā)酵液搬性能測(cè)試/jpkc篩選模體型：形春態(tài)依據(jù)真菌的分震離篩選：擁以啤酒酵遮母的分離鬧為例取發(fā)酵覺液少許淘以10辭倍稀釋飽成10-1-10-7稀釋分拌離法取0.1奇ml加惰入固體培匪養(yǎng)基鋪平泥皿（×2蛛）在麥芽限汁固體獵培養(yǎng)基錢上，2貧5℃培驅(qū)養(yǎng)48賀-72核h形態(tài)篩選排根據(jù)正常課株特點(diǎn)進(jìn)癥行挑選，口接種斜面頸備用純化，采燈用平板分袋離法進(jìn)一笑步純化，想至少反復(fù)剪三次①生成子臘囊孢子速擊度測(cè)定速②發(fā)翁酵力測(cè)定性能測(cè)定翻③熱死溫怖度測(cè)定④凝集力證測(cè)定⑤雙乙酰栽含量測(cè)定/jpkc菌種選篇育改良董的具體垃目標(biāo)提高目何標(biāo)產(chǎn)物浩的產(chǎn)量提高目標(biāo)釀產(chǎn)物的純軟度，減少白副產(chǎn)物改良菌恩種性狀走，改善丘發(fā)酵過僑程改變生臘物合成吹途徑，蛛以獲得叨高產(chǎn)的肝新產(chǎn)品/jpkc發(fā)酵工業(yè)曲菌種改良飼方法常規(guī)育寒種(誘變育種)細(xì)胞工程歲育種基于代咐謝調(diào)節(jié)簽的育種始技術(shù)基因工漆程育種蛋白質(zhì)工撿程育種代謝工程減育種/jpkc賴氨酸物生產(chǎn)菌唉種的選撓育改良躬思路出發(fā)菌惠株：黃色短流桿菌、谷瞇氨酸棒桿疏菌、乳糖耐發(fā)酵短桿額菌育種思路1.優(yōu)先健合成的轉(zhuǎn)壓換——滲棟漏缺陷型腹的選育2.切斷憲支路代謝辛——營養(yǎng)凈缺陷型的遞選育：高該絲氨酸缺取陷型3.抗梳結(jié)構(gòu)類認(rèn)似物突胡變株的沒選育：混AEC4.解除撇代謝互鎖歌：Leu-、抗Leu柔結(jié)構(gòu)類似鎮(zhèn)物、景喹啉s、苯貞醌s5.增加覆前體物的遇合成和阻船塞副產(chǎn)物控的生成：Ala-、抗A惱sp結(jié)磁構(gòu)類似薯物選育適宜稅的CO2固定酶/廁TCA循言環(huán)酶活性羽比突變株6.改善疏細(xì)胞膜的列透過機(jī)能7.虹選育溫案度敏感障突變株8.應(yīng)饞用細(xì)胞工殼程和基因廣工程育種選育適川宜的CO2固定酶渠/TC遍A循環(huán)餡酶活性謹(jǐn)比突變是株賴氨酸合勤成中間代御謝有以下盞兩條途徑岸：①通過TCA循環(huán)葡萄糖柜丙酮酸歌草酰乙舅酸腦天冬冒氨酸賴氨酸②通過磷倡酸烯醇結(jié)丙酮酸戴羧化反筑應(yīng)葡萄糖尖磷酸斃烯醇下草酰乙振酸涉天冬氨救酸式丙酮疲酸丙酮酸賴氨酸/jpkc代謝工程夏的定義利用多曬基因重嚴(yán)組技術(shù)董有目的啟地對(duì)細(xì)污胞代謝小途徑進(jìn)阿行修飾隙、改造行，改變臘細(xì)胞特束性，并榨與細(xì)胞伸基因調(diào)俘控、代吉謝調(diào)控星及生化千工程相卡結(jié)合，飛為實(shí)現(xiàn)州構(gòu)建新答的代謝泛途徑，池生產(chǎn)特反定目的旅產(chǎn)物而掠發(fā)展起水來的一擺個(gè)新的撕學(xué)科領(lǐng)業(yè)域。又稱作禾途徑工鍋程，是昌多基因米的基因趣工程。/jpkc代謝工諒程發(fā)展基嬸礎(chǔ)代謝網(wǎng)梯絡(luò)理論紗：是把飾細(xì)胞的膛生化反猾應(yīng)以網(wǎng)竊絡(luò)整體余，而不蚊是孤立著地來考丹慮。代謝網(wǎng)焰絡(luò)分流熊處的代她謝產(chǎn)物練稱為節(jié)秧點(diǎn)，其嫂中對(duì)終邁產(chǎn)物合時(shí)成起決鐘定作用名的少數(shù)伸節(jié)點(diǎn)稱盤為主節(jié)炕點(diǎn)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)趴下游分支挪的可變程斑度，節(jié)點(diǎn)府分為：柔性節(jié)條點(diǎn)：解搏除一個(gè)弦分支的瘋反饋抑泰制可提任高該分大支下游卵產(chǎn)物的迫產(chǎn)量。半柔性交節(jié)點(diǎn)：須降癢低主分前支的酶零活并同如時(shí)提高撈次分支龍的酶活寺或解除表其反饋拾抑制，適才可提習(xí)高次分純支下游傷產(chǎn)物的千產(chǎn)量。剛性節(jié)爐點(diǎn)：其下模游各分裙支的比賤例不易猾改變。/jpkc代謝工程發(fā)展基想礎(chǔ)相依網(wǎng)絡(luò)：代謝網(wǎng)僚絡(luò)中各主果節(jié)點(diǎn)集中謎于產(chǎn)物，禾為了避免送中間物的攀過量積累蹄，各分支伶的代謝流付都必須保閉持平衡，輛各分支的月分流相等按，各節(jié)點(diǎn)支的重要性皇相同。獨(dú)立網(wǎng)忠絡(luò)：代謝襖網(wǎng)絡(luò)的掛主節(jié)點(diǎn)漸不集中沖，可以首通過對(duì)勇代謝的油修飾來趟影響產(chǎn)談物的產(chǎn)層量,其姜對(duì)代謝寄修飾的塘應(yīng)答能桑力，取互決于各舌節(jié)點(diǎn)的賢剛?cè)嵝晕杓捌湮圾Q置。S陰I榆P獎(jiǎng)S紙Ⅰ寒Ⅱ散PⅡ沈B究B1B2相依網(wǎng)屬路獨(dú)立網(wǎng)路/jpkc（三）代漸謝工程育持種思路1.改變代謝村流：改變分量支代謝辦途徑的膽流向，員阻斷有同害代謝著產(chǎn)物的艇合成。（1）加屬速限速反茂應(yīng)（2）足改變分狠支代謝潤途徑流沫向：提高代謝吐分支點(diǎn)的話某一分支仗代謝途徑款酶系的活風(fēng)力，在與遇另外的分須支代謝途巷徑的競爭飛中占有優(yōu)歐勢(shì)，可以煉提高目的