膠體金生產(chǎn)工藝配方原則演示文稿

膠體金生產(chǎn)工藝配方原則演示文稿1目前一頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點（優(yōu)選）膠體金生產(chǎn)工藝配方原則目前二頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點3一、和膜相關(guān)的配方和原理電鏡下的NC膜目前三頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點4硝酸纖維膜生產(chǎn)工藝圖目前四頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點5孔徑定義的問題目前五頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點6孔徑對側(cè)向?qū)游鏊俣鹊挠绊懩壳傲揬總數(shù)七十三頁\編于十三點7不同種類膜的IgG結(jié)合能力目前七頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點8不同種類膜的BSA結(jié)合能力目前八頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點9為什么蛋白會結(jié)合到膜上?結(jié)合力是什么?靜電疏水力這兩種結(jié)合力的效應(yīng)是什么?使蛋白從溶液中分離出來長久結(jié)合作用目前九頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點10靜電作用力靜電作用力是正負電荷相互吸引產(chǎn)生的作用力疏水作用力疏水作用力又稱為疏水鍵。它是由側(cè)鏈的疏水基團相互接近.而形成的一種作用力。對維持分子的三、四級結(jié)構(gòu)起著重要的作用。每一個蛋白質(zhì)都具有疏水基團和親水基團。目前十頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點11蛋白質(zhì)疏水性狀和親水性狀當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解在溶劑中時，蛋白質(zhì)處于非常穩(wěn)定的狀態(tài)，此時蛋白質(zhì)的親水基團展開在外，疏水基團收縮在內(nèi)，親水基團和水分子接觸，保證了溶解性的狀態(tài)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)沉淀出來時，疏水基團展開，親水基團收縮，此時為疏水狀態(tài)，也呈現(xiàn)不穩(wěn)定的固體狀態(tài)，疏水基團和其他固體物的疏水基團通過疏水作用力結(jié)合，達到固定的目的。目前十一頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點12蛋白結(jié)合到固相材料上蛋白結(jié)合到固相材料上是一個多步驟過程取決于蛋白溶液擴散到固相表面蛋白從溶液中分離出來蛋白吸附到固相上蛋白重排到最低能態(tài)目前十二頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點13吸附過程溶液中的蛋白蛋白轉(zhuǎn)移到表面區(qū)域吸附蛋白在表面重排目前十三頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點14多位點結(jié)合只有1個位點的結(jié)合是可逆的多位點結(jié)合使得蛋白穩(wěn)定在固相表面，即使其中的每個單位點都是可逆的目前十四頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點15影響蛋白結(jié)合的因素蛋白緩沖液使用的膜蛋白自身應(yīng)用體系目前十五頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點16蛋白緩沖液沒有通用的緩沖液，不同的系統(tǒng)必須分別優(yōu)化。作用：提供適合的PH,改善親水性,增溶性,提高穩(wěn)定性定律:

“蛋白在緩沖液中越不穩(wěn)定，蛋白結(jié)合力越強”目前十六頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點17緩沖液的優(yōu)化離子強度對于蛋白從溶液中脫離出來很重要，少量的離子強度，蛋白難以從溶液中脫離沉淀出來，過量的的離子強度，溶液配制中就已會出現(xiàn)沉淀。pH蛋白在等電點最不穩(wěn)定沉淀劑通常用醇降低蛋白的穩(wěn)定性，也可潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利于結(jié)合包被。鹽通常不會影響對某些蛋白，兩性離子的鹽類有助于蛋白結(jié)合減少信號強度，消假陽目前十七頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點18糖：對包被蛋白的穩(wěn)定性有重要作用，減緩老化速度，也可以增加親水力。惰性蛋白：對消除假陽有重要作用表面活性劑：增加親水力，也可增色。目前十八頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點19緩沖液的基本成分各種緩沖系:Tris-HCl,PB,CB等鹽類：NaCl糖：蔗糖，海藻糖等表面活性劑：Tween20，Tritonx-100等惰性蛋白：Casein等防腐劑：疊氮鈉，卡松等目前十九頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點20推薦的起始緩沖液10mMPhosphatepH7.03%Ethanol目前二十頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點21“潛水艇”效應(yīng)表面活性劑處理過的膜在使用時的常見問題因為使用的表面活性劑是水溶性的噴膜時這些表面活性劑被“沖走”了目前二十一頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點22反應(yīng)動力學(xué)流速增加,反應(yīng)速率減低流速增加,檢測時間縮短流速增加,靈敏度降低流速增加,試劑用量增加流速增加,背景降低距離增加,流速降低孔徑增加,蛋白結(jié)合量減少目前二十二頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點23二、和金子墊相關(guān)的配方和原理

和金子墊相關(guān)的工藝和配方有：1）標(biāo)記工藝；2）金標(biāo)稀釋液3）金墊處理液目前二十三頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點24標(biāo)記工藝膠體金：一般指金的水溶液，又稱金溶膠。---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶膠。其中分散的金顆粒直徑一般在1~100nm之間，為負電荷分布。目前二十四頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點25高質(zhì)量結(jié)合物單個分散的顆粒圓形顆粒很少聚集這樣得到的膠體穩(wěn)定性和重復(fù)性好Clusterfree,highqualitygoldreagentClustered,poorqualitygoldreagent目前二十五頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點26膠體金的生產(chǎn)膠體金的形成是還原HAuCl4.HAuCL4+e-Au0還原劑越強，得到的金顆粒越小生產(chǎn)40nm診斷用金顆粒一般用檸檬酸三鈉目前二十六頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點27膠體金顆粒的形成目前二十七頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點28膠體金的生產(chǎn)2種重要步驟直接形成分步形成大多數(shù)人用分步形成比較容易控制顆粒大小，CV也比較小能夠生產(chǎn)出大顆粒膠體金目前二十八頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點29顆粒大小對膠體的影響目前二十九頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點30蛋白標(biāo)記原理蛋白質(zhì)在等電點或稍偏堿的情況下，依靠靜電引力或疏水力或共價鍵，被牢固地吸附于膠體金顆粒表。由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒表面，形成一個蛋白層，從而阻止了膠體金顆粒的相互接觸，使該膠聯(lián)溶液較為穩(wěn)定。目前三十頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點31要點蛋白的預(yù)處理使用低濃度和正確的pH值，確保最小的聚集合適的蛋白量（可通過鹽滴定進行評價）攪拌速度、容器的潔凈程度、離心的速度目前三十一頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點32鹽滴定鹽滴定不能衡量蛋白單層的形成鹽滴定只能代表鹽溶液中多少量的蛋白可以使膠體金穩(wěn)定pH和時間都會有影響目前三十二頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點33蛋白邦定作用力電荷作用力（靜電作用力）疏水力共價鍵目前三十三頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點34目前三十四頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點35金標(biāo)稀釋液合適的離子種類和強度，0.2M左右，常用有磷酸鹽等。大分子物質(zhì)作為膠體金干燥后均勻散布的骨架，常用大分子物質(zhì)如PEG4000，PEG20000，PVP。小分子物質(zhì)對蛋白活性保護，

蛋白儲存常用的甘油、蔗糖、海藻糖、各類低聚糖等，對產(chǎn)品的儲存穩(wěn)定性有幫助。

目前三十五頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點36惰性蛋白，它是保護目的蛋白的活性，也維持膠體金的膠體穩(wěn)定，它們是消除非特異性的封閉物質(zhì)，也起著有分散膠體金顆粒的骨架作用。常用有BSA、OVA、Casein。表面活性劑，具有增加親水性，促進結(jié)合等作用。常用的有Tween-20，Tritonx-100。

目前三十六頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點37評價金標(biāo)稀釋液的參數(shù)金子釋放程度及速度。金標(biāo)液穩(wěn)定性。靈敏度、特異性目前三十七頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點38結(jié)合物釋放墊的原理什么是結(jié)合物釋放墊?孔徑開放快速層析低蛋白結(jié)合力理想的親水性傳統(tǒng)材料是包被PVA的玻纖目前三十八頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點39典型結(jié)合物釋放墊材料的構(gòu)意圖玻纖高分子PVA外殼目前三十九頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點40側(cè)向?qū)游鲋薪Y(jié)合物釋放墊的原理做什么用(理論上)？讓結(jié)合物完好無損的干燥加樣后讓結(jié)合物快速釋放實際應(yīng)用中側(cè)向?qū)游鲋薪Y(jié)合物釋放墊可能遇到的問題比其它任何組分都多目前四十頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點41標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合物釋放墊的性能45秒內(nèi)釋放出約70%的結(jié)合物但是墊上保留的結(jié)合物降低了靈敏度，因為:較少的結(jié)合物到達捕獲線較少的抗原到達捕獲線在側(cè)向?qū)游鱿到y(tǒng)中靈敏度要好線條CV值一般在15-20%目前四十一頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點42儲存于20oC時結(jié)合物釋放率目前四十二頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點43金墊處理液作用：增加親水性,促進復(fù)溶,保持穩(wěn)定性基本成分：1）緩沖系統(tǒng)：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物緩沖液等。2）表面活性劑：Tween-20，Tritonx-100等。3）大分子物質(zhì)：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA4）惰性蛋白：BSA、OVA、Casein。5）小分子保護物質(zhì)：糖類物質(zhì)，如蔗糖，海藻糖等。

目前四十三頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點44結(jié)合物釋放常見問題釋放不充分釋放慢釋放墊再次濕潤困難目前四十四頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點45釋放不充分結(jié)合物綁定到釋放墊上了用聚合物和表面活性劑封閉釋放墊在儲存過程中，結(jié)合物發(fā)生聚集控制封閉劑的用量控制溶液的離子強度目前四十五頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點46釋放慢您的釋放墊是怎樣封閉的?是否加了親水試劑？是否用了大量的蛋白?是否用了大量的糖?試紙條各組分之間接觸緊密么?目前四十六頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點47釋放墊再次濕潤困難您使用的是哪一種釋放墊?是親水的么?您是怎樣封閉釋放墊的?目前四十七頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點48三、和樣品墊相關(guān)的配方和原理作用：改變樣本PH,調(diào)節(jié)爬速,控制金標(biāo)釋放，抑制非特異性吸附,降低背景基本成分：1）緩沖系統(tǒng)：磷酸，碳酸，硼酸，Tris,生物緩沖液等。2）表面活性劑：Tween-20，Tritonx-100等。3）大分子聚合物質(zhì)：PEG4000，PEG20000，PVP，PVA4）惰性蛋白：BSA、OVA、Casein。5）生物物質(zhì)：鼠IGg，抗紅細胞抗體等。目前四十八頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點49血清類樣品墊注意爬速，背景，靈敏度的達到和假陽的消除。全血類樣品墊1）必須能夠去除紅細胞！2）還需具備下列功能不能造成溶血不能干擾樣品分離必須快速高效必須能夠分離一定范圍內(nèi)的不同血樣量靈敏度的達到和假陽的消除目前四十九頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點50尿液類樣品墊注意交叉反應(yīng)的消除。目前五十頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點51影響抗原抗體反應(yīng)的外部因素電解質(zhì)抗原與抗體發(fā)生結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體的過程中須有電解質(zhì)參與才能進一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，水化層破壞，復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊的凝集或沉淀。若無電解質(zhì)參加，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用O.85％氯化鈉或各種緩沖液作抗原及抗體的稀釋液及反應(yīng)液。但電解質(zhì)的濃度不宜過高，否則會出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。目前五十一頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點52酸堿度蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點?？乖贵w反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進行，pH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)?？乖贵w反應(yīng)一般在pH為6～9進行。目前五十二頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點53溫度抗原抗體反應(yīng)必須在合適的溫度中進行，一般以15～40℃為宜，最適反應(yīng)溫度為37℃。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)，對溫度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4℃左右與紅細胞結(jié)合最好，20℃以上反而解離。目前五十三頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點54反應(yīng)時間反應(yīng)時間越長，抗原抗體反應(yīng)越充分，顯色也越深。所有調(diào)整輔料的思路都可從抗原抗體反應(yīng)的影響因素和輔料的成分性質(zhì)進行考慮和設(shè)計。目前五十四頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點55四、相關(guān)問題假陽問題假陰問題穩(wěn)定性問題上樣問題目前五十五頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點56（一）假陽問題未標(biāo)記上的金顆粒（裸金）電荷作用疏水作用硫醇類物質(zhì)的存在（S-H鍵起作用）抗原抗體作用（內(nèi)源性物質(zhì)）抗凝劑和防腐劑的影響其他原因目前五十六頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點57未標(biāo)記上的金顆粒（裸金）裸金聚集，周圍具有大量的負電荷，當(dāng)樣本爬過金墊，裸金隨著向上跑，在T線位置只要碰到帶有正電荷的蛋白，即發(fā)生反應(yīng)，形成假陽線條。解決方法：檢查標(biāo)記過程，BSA封閉目前五十七頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點58電荷作用

膠體金顆粒帶有負電荷，當(dāng)遇上帶有正電荷的蛋白，易發(fā)生非特異性結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致假陽。反應(yīng)環(huán)境為酸性時，已發(fā)生此類結(jié)合。解決方法：改變pH和鹽度目前五十八頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點59疏水作用抗原抗體結(jié)合以及和膠體金結(jié)合都需要用到疏水作用力，當(dāng)反應(yīng)環(huán)境中存在疏水物質(zhì)時，易和膠體金或抗原抗體通過疏水作用力結(jié)合，產(chǎn)生假陽結(jié)果，如標(biāo)本里的一些脂肪，細胞碎片，細菌等等。解決方法：用表面活性劑或親水聚合物進行處理。目前五十九頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點60抗原抗體作用此類作用是指標(biāo)本里面含有能和標(biāo)記材料/包被材料發(fā)生免疫反應(yīng)的非目標(biāo)物的其他物質(zhì)導(dǎo)致的假陽結(jié)果。常見的有毒品的交叉反應(yīng)，如KET試劑檢測美沙酮標(biāo)本，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，就是美沙酮和KET材料發(fā)生了交叉反應(yīng)；又有SG試劑中的抗鼠抗體反應(yīng)等等。解決方法：在樣品墊或金子墊或硝酸纖維素膜上加入相應(yīng)的抗體，將這類物質(zhì)在T線前消除掉。目前六十頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點61在血清檢測中的具體非特異性反應(yīng)物質(zhì)大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等。目前六十一頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點62類風(fēng)濕因子

人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性。解決該情況的辦法是：(1)用F(ab)2替代完整的IgG；(2)標(biāo)本用預(yù)先熱變性(63℃，10min)IgG的固相吸附劑處理(將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效)；(3)檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。目前六十二頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點63補體

如果在包被和標(biāo)記過程中，使用的抗體的FC段的補體Clq分子結(jié)合位點被暴露出來，從而易使Clq可以將補體和抗體二者連接起來，造成假陽性現(xiàn)象。解決的方法是：(1)用EDTA稀釋標(biāo)本；(2)用53℃、10min加熱血清使Clq滅活。目前六十三頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點64嗜異性抗體人類血清中含有能與嚙齒類動物(如鼠等)Ig(s)結(jié)合的天然嗜異性抗體，易和包被和標(biāo)記的抗體產(chǎn)生反應(yīng)，能造成假陽性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動物Ig(s)，但加入量不足或亞類不同時無效。目前六十四頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點65醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體（嗜異性抗體的一種）臨床開展的用鼠源性CD3等克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig(s)抗體。解決的方法是：測定抗原時，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig(s)，從而克服由于上述原因造成的假陽性。目前六十五頁\總數(shù)七十三頁\編于十三點66例子：Sg采用了雙抗體夾心的方法進行檢測，包被材料和標(biāo)記材料都是單克隆抗體，屬于鼠IGg類別，由于人體經(jīng)常和動物打交道，體內(nèi)易產(chǎn)生嗜異性抗體，如抗鼠抗體，抗?？贵w等等，這類嗜異性抗體極易導(dǎo)致假