第十三章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)CR

第十三章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(PCR)1第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)PCR是一種選擇性擴(kuò)增目的DNA(或RNA)的方法.2一、PCR的基本原理和反應(yīng)過(guò)程1.PCR的基本原理原理:DNA的變性、復(fù)性、半保留復(fù)制。2.PCR的基本過(guò)程基本過(guò)程:變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟3①變性:DNA高溫變性，加熱至90－95℃并維持一定時(shí)間，使雙鏈DNA氫鍵斷裂，解離成為單鏈，成為模板。

4②退火:變性DNA分子在溫度降至適當(dāng)時(shí)，重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，該過(guò)程稱為退火。在PCR過(guò)程中,當(dāng)溫度降至45-55℃時(shí)，單鏈DNA模板與人工合成的引物DNA結(jié)合.5③延伸:當(dāng)PCR溫度升至70-75℃度時(shí)，在加入的DNA聚合酶的催化作用下，體系中的4種游離的dNTP遵循堿基互補(bǔ)原則，按引物5'→3'方向合成模板DNA新的互補(bǔ)鏈。6高溫變性低溫復(fù)性適溫延伸95℃55℃72℃78整個(gè)PCR過(guò)程一般需要30次循環(huán)，從理論上講能將目的DNA擴(kuò)增230倍，約為109倍.PCR的平均擴(kuò)增效率約為75%～85％，完成一次循環(huán)需2-3分鐘，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后擴(kuò)增的倍數(shù)約為(1+75%)n。2-3小時(shí)就能將目的DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍。9

二、PCR的特點(diǎn)⒈特異性強(qiáng)擴(kuò)增的目的DNA，可以是DNA混合物中的某個(gè)特定分子，也可以是DNA大分子的某段特定序列10⒉靈敏度高應(yīng)用PCR技術(shù)可以對(duì)一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中得到的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增、分析和鑒定。在病毒學(xué)檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)檢測(cè)中，PCR的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。11⒊簡(jiǎn)便快捷PCR技術(shù)使用的是耐高溫的TaqDNA聚合酶，且已有各種PCR擴(kuò)增儀供應(yīng)。只需將反應(yīng)液一次性地加好，然后設(shè)置一定程序，即可在DNA擴(kuò)增儀中進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2-4小時(shí)就能完成

12⒋對(duì)樣品要求低病毒細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)胞，其DNA或RNA粗制品均可作為擴(kuò)增模板。擴(kuò)增樣品可以是新鮮的，也可以是陳舊的；可直接用臨床標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增，如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等。13三、PCR的體系組成和反應(yīng)條件

（一）體系組成:模板（目的DNA(RNA)）耐熱DNA聚合酶寡核苷酸引物原料:dNTP緩沖液和MgCl2反應(yīng)體積一般選用50-100μl141.引物:決定PCR的特異性PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA結(jié)合的特異性。故引物設(shè)計(jì)在PCR技術(shù)中十分重要。PCR擴(kuò)增的是一個(gè)雙鏈目的DNA，所以需要兩條引物，分別與目的DNA的兩股鏈的3’端互補(bǔ)。引物合成方法:化學(xué)的方法合成，原則如下：15⒈引物劍長(zhǎng)度碎合適:不少妨于15個(gè)核直苷酸利，一睬般為15－30個(gè)核逼苷酸⒉引物勢(shì)堿基煤組成匙與分濾布隨適機(jī):訊AT董CG隨機(jī)世分布,避免5個(gè)以雜上嘌摟呤或忽嘧啶鳥(niǎo)串聯(lián)狀排列,C擺+G含量哀以40叔%-尖60任%為宜16⒊兩勾條引房誠(chéng)物的撒堿基蠢組成善一致:堿基仿組成翻影響摟退火提溫度矩，兩聯(lián)條引閃物的堤堿基喜組成決一致管，可搬以確會(huì)保適僅用相皂同的妻退火橋溫度⒋引夫物內(nèi)永部避桶免出避現(xiàn)二憑級(jí)結(jié)慮構(gòu):引物鉤自身顏互補(bǔ)渣序列銹不能馳超過(guò)3b忍p，以買防止鞠形成攻莖環(huán)榜結(jié)構(gòu)17⒌引物抽之間丟不應(yīng)擇互補(bǔ):特別族是3’端的而互補(bǔ)封，否宗則會(huì)炸形成筐引物鴨二聚吵體⒍引物3’端繭堿基葡要求澤嚴(yán)格最配對(duì):特別片是最繼末及窩倒數(shù)溝第二喪個(gè)堿懶基,以避置免因砍末端李堿基芹不配昌對(duì)而傅導(dǎo)致PC艱R失敗18⒎引錘物的5’端可捆以修拼飾:引物5’端不禾互補(bǔ)技不影超響PC尚R，可說(shuō)以修腔飾，曉包括飾加接案限制繭酶識(shí)奸別序市列或梯密碼叫子序牲列，越引入若突變們位點(diǎn)痰或末渾端標(biāo)況記⒏引戴物應(yīng)葵嚴(yán)格仇特異:為防葛止非虜特異季性擴(kuò)律增，畝引物刪與樣托品中貢的其鉗他序喬列應(yīng)兆無(wú)明貍顯同真源性慌，一議般同毀源性通不超且過(guò)70然%。19⒐引物講量合餡適災(zāi)在PC耍R體系范中，黎每條非引物葬的濃歸度應(yīng)考為0.午1-覺(jué)1μ掘mo統(tǒng)l或10妄-1講00澤pm海ol。引距物濃初度過(guò)叔高會(huì)燦引起亮錯(cuò)配佳和增從加引改物之懸間形織成二副聚體螺的機(jī)歌會(huì)，犧發(fā)生粥非特夕異性棕?cái)U(kuò)增雄。⒑引物終質(zhì)量庫(kù)好:需要檔純化固，聚熊丙烯錦酰胺支凝膠到電泳墨法或幸反向失高壓剩液向瓣層析分法。20㈡酶及哈其濃灶度Ta臥qDN漁A聚合五酶是從贏水生違棲熱箱菌(Th盜er近mu烏saq莊ua狗ti億cu齒s，Ta醋q)分離坦出來(lái)葵的，莊故Ta煙qDN千A聚合扎酶有制良好幕的熱皆穩(wěn)定敢性，盆在92峽.5震℃、95逃℃和97還.5盤℃下的抵半衰收期分割別為13遵0、40和5－6分鐘羽。其蝕催化DN益A合成鉗的活絡(luò)性可花適應(yīng)估相當(dāng)挎寬的少溫度錯(cuò)范圍民，但并在75熱℃－80育℃活性像最高哈，降漫低溫艦度則毀擴(kuò)增衡效率學(xué)隨之佛降低欣。21特點(diǎn)：①以DN擾A為模妙板，dN纏TP為底費(fèi)物，詠與目淋的DN飄A結(jié)合澆的引死物的3’端為緩起點(diǎn)躲，遵家循堿窩基互蚊補(bǔ)原麗則，怖按5’灶→3'的方貝向合夕成DN籌A新鏈故。②有5'客→3徹'外切弱酶的凈活性喝，但墻無(wú)3'蘆→5燦'外切暖酶的導(dǎo)活性替，所游以沒(méi)借有校膽對(duì)功藍(lán)能，安其錯(cuò)膀誤率恰為0.午25旬%，即差擴(kuò)增鉗產(chǎn)物團(tuán)中每40都0個(gè)堿妄基可近能出途現(xiàn)一鍬個(gè)錯(cuò)唐誤摻廣入的蠻堿基獲。22③具桑有反幸轉(zhuǎn)錄奔酶活緊性，熟可直而接用窗于從RN納A擴(kuò)增cD以NA，使RT無(wú)-P禽CR技術(shù)鍋簡(jiǎn)化臥，但稱該活繳性依扎賴Mg2+或Mn2+。④具躲有類瓣似末軋端轉(zhuǎn)數(shù)移酶共的活資性，乖可在么新合襲成鏈涂的3'端加薪上一湊個(gè)不樂(lè)依賴摔模板罪的核溉苷酸嘆，而癢且優(yōu)蜘先加刺接dA謙TP，利赤用這朝一性排質(zhì)可廣以構(gòu)益建載妙體,克隆譜帶dA嶼TP尾的PC慮R產(chǎn)物興。23濃度豆：催化敬一典蝴型的PC歷R所需簽酶量弱約為2.跟5U咱(指總姥反應(yīng)鉛體積隸為10泛0μ乞l時(shí))，濃共度過(guò)機(jī)高可妄發(fā)生較非特欣異性射擴(kuò)增碼，濃呆度過(guò)瓶低則籍降低辟擴(kuò)增拒效率艇。24㈢dN賴TPdN案TP是PC逆R的底背物，散其濃港度、輪比例未和質(zhì)鵲量與臭反應(yīng)毫密切頓相關(guān)歌：濃踩度應(yīng)拔根據(jù)孟靶序譽(yù)列的扇長(zhǎng)度價(jià)和組夸成確稀定，導(dǎo)一般敲在20親-2坦00院μm獻(xiàn)ol肺/L之間兆，并的且4種dN碼TP的摩甜爾濃尿度要圾相等弊。過(guò)高僅反斗應(yīng)速臺(tái)度壟堿基辨錯(cuò)配許率過(guò)低糕反平應(yīng)的領(lǐng)準(zhǔn)確針性鋪擴(kuò)斬增效絨率25㈣待擴(kuò)乎增樣名品PC則R的樣泊品可目以是DN辰A或RN盟A如為RN凳A時(shí)，猜應(yīng)先怠逆轉(zhuǎn)傲錄生到成cD淡NA，然貴后再畫(huà)進(jìn)行窗正常廳的PC漁R循環(huán)病原革體標(biāo)閥本：船如病茅毒、羽細(xì)菌保、真狐菌、犁支原雄體、仙衣原樹(shù)體、峽立克掩次氏舍體等臨床臘標(biāo)本歉：如員細(xì)胞蛛、血愧液、谷尿液回、分窄泌物討、羊透水等法醫(yī)縣學(xué)標(biāo)濟(jì)本：崖犯罪毯現(xiàn)場(chǎng)畫(huà)的血坑跡、秘精斑懼、毛謀發(fā)等考古渠標(biāo)本衫：26㈤Mg2+濃度Mg2+可以朱影響編解鏈搜溫度片、退輛火溫饑度、氏影響夏酶活吼性、南產(chǎn)物煉的特雹異性宵、引冬物二舒聚體騙的形哪成等一般閃在0.砌2－2.浮5m抬mo翠l/柏L之間壇，常塑用1.挺5m總mo林l/撐L。27組成量10×擴(kuò)增緩沖液10μl4種dNTP混合物各200μmol/L引物各10-100pmol模板DNA0.1-2μgTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L加雙或三蒸水至100μlPC消R體系抽組成28（二刮）反有應(yīng)條決件1.反應(yīng)疊溫度或與時(shí)寸間①變性飲溫度慎與時(shí)絞間：95零℃、30秒鐘添或97欲℃、15秒鐘普（逃第一宇次變桃性5～7分鐘胡）②退火塵溫度司與時(shí)嚼間：45早℃－55鏡℃，30－60秒鐘③延伸飼溫度恩與時(shí)筐間：70－75稠℃，30－60秒鐘原（最言后一寄次延仔伸延熔長(zhǎng)5分鐘劈燕）29Ta觀qDN妖A聚合扒酶的姥活性川受溫配度影蓬響：衡在70－80胃℃時(shí)，紡每個(gè)館酶分瞧子每差秒鐘星可催掃化延店伸約15橡0個(gè)核績(jī)苷酸煎，在70畏℃時(shí)為60個(gè)核淡苷酸基，在55順℃時(shí)為24個(gè)核具苷酸觀，高羨于90個(gè)℃時(shí)幾良乎完破全失富活。30PC芹R的延狼伸時(shí)術(shù)間可觀以根勉據(jù)目論的DN抖A的長(zhǎng)灘度確敘定：1k秧b以內(nèi)傘一般伙延伸1分鐘朵，3－4k百b需延到伸3－4分鐘突，10刺kb需延役伸15分鐘歡。延菜伸時(shí)稍間過(guò)些長(zhǎng)會(huì)昌降低冊(cè)擴(kuò)增匙特異松性。鈴如果坦模板墓?jié)舛确逄团f，延調(diào)伸時(shí)鉗間要凳稍長(zhǎng)體些。312.緩沖海液：寄提供PC碼R反應(yīng)華合適面的酸腫堿度吵和某駐些離詞子（孤主要修是Mg2+）。登常用10－50敲mm朋ol勢(shì)/LTr瓣is撥-H述Cl(2拴0℃時(shí)，pH竹=8箱.3－8.占8，72首℃時(shí)pH盾=7袍.2撥)緩沖路液。323.循環(huán)院次數(shù)PC飽R循環(huán)易次數(shù)跳的設(shè)筋定主瞧要取頑決于醫(yī)初始動(dòng)目的DN走A的濃親度。目一般產(chǎn)的循畫(huà)環(huán)次缸數(shù)選槳在30－40次之鑼間。律循環(huán)笨次數(shù)仁太少隙，產(chǎn)齒物的駕量不潮夠多冠；循納環(huán)次擠數(shù)越標(biāo)多，宴由于蠶各種割原因桑越容旋易發(fā)橋生錯(cuò)聚誤摻神入，達(dá)從而乏降低蜜擴(kuò)增村特異腔性。33原則膝是：沿在滿帽足產(chǎn)陸量的啟前提鎖下，準(zhǔn)應(yīng)盡灶量減測(cè)少循厭環(huán)次脅數(shù)。太如果遠(yuǎn)產(chǎn)量鈴不夠匠，可行將產(chǎn)握物適罵當(dāng)稀撈釋，縣再繼懼續(xù)擴(kuò)斑增。34四、PC堅(jiān)R擴(kuò)增織產(chǎn)物紋的分厘析㈠凝膠炕電泳祝分析凝膠腐電泳們可幫共助判商斷擴(kuò)甩增產(chǎn)托物的倉(cāng)大小鎮(zhèn)、檢厘測(cè)擴(kuò)訴增情邪況，紋從而范對(duì)擴(kuò)柔增產(chǎn)品物進(jìn)略行鑒逝定3536㈡酶扶切分臨析根據(jù)PC套R(shí)產(chǎn)物傭中存征在的從限制就性內(nèi)搶切酶秒的識(shí)玩別位心點(diǎn)，瞧用相瘦應(yīng)的亮限制表性內(nèi)妖切酶明切割蕩，電蒸泳分鑰析酶涌切片不段，仗對(duì)產(chǎn)昏物進(jìn)終行鑒撓定，味靶基丙因分載型，請(qǐng)還能擱進(jìn)行譽(yù)變異買性研嘆究。37㈢分子倍雜交分子公雜交本是即乳可檢兔測(cè)PC芝R產(chǎn)物塞的特塵異性威，也嚴(yán)可檢氣測(cè)PC勉R產(chǎn)物戒的堿刊基突醒變。崗包括So福ut鉛he喬rn印跡接法，最斑點(diǎn)壁雜交粘，微灘孔板鹽雜交亡法等38㈣DN叛A測(cè)序測(cè)序云是檢閉測(cè)PC捉R產(chǎn)物懲特異惱性的瞇最可道靠方診法。艘能對(duì)鋼靶基除因分白型，役還能基進(jìn)行揭變異某性研震究。39第二尼節(jié)PC派R技術(shù)殘的發(fā)野展⒈逆轉(zhuǎn)派錄PC掛R逆轉(zhuǎn)學(xué)錄PC橋R(憂RT萬(wàn)-P茂CR倚)是以mR使NA為模沫板，灑由逆衰轉(zhuǎn)錄失酶催翻化合cD淘NA，將cD尾NA通過(guò)PC暈R擴(kuò)增抵，擴(kuò)死增產(chǎn)甲物再信走凝胞膠電會(huì)泳，翠通過(guò)連分析類電泳攀圖譜蠶可以抽鑒定cD泊NA的長(zhǎng)抗度，cD慕NA的長(zhǎng)蠅度即底為mR狀NA的長(zhǎng)肅度，粉進(jìn)而聰推斷蠶是否店存在摟基因扁缺失濤或插港入，源以及mR傲NA加工您過(guò)程潛是否婦異常抖。40如果襯對(duì)電挨泳圖脆譜進(jìn)則行光就密度旗掃描顛，還萍可以州計(jì)算寬出相螺應(yīng)的mR吉NA量。RT擱-P繼CR使微醫(yī)量mR絹NA的信區(qū)息迅兵速擴(kuò)可增，填大大住提高蒼了mR圈NA檢測(cè)銀的靈陽(yáng)敏度薪。41⒉定量PC至R應(yīng)用艱定量PC鉤R技術(shù)華可以搞定量前檢測(cè)盲樣品悼中目姜的DN銜A的拷飯貝數(shù)術(shù)。通器過(guò)測(cè)壺定PC吸R擴(kuò)增浪產(chǎn)物盒的量猶推測(cè)被出原魄始樣溉品中樸目的DN范A的拷煎貝數(shù)省。42必須扎設(shè)立故內(nèi)參采照。滿具體林的方慮法是牲，將心目的DN都A和一來(lái)個(gè)單炊拷貝擁對(duì)照DN籌A放在邪同一戲試管病中進(jìn)樣行PC抱R擴(kuò)增額；然聚后將壞擴(kuò)增最產(chǎn)物驗(yàn)走電困泳，識(shí)使擴(kuò)舍增的旨目的DN耀A和對(duì)身照DN窩A分離類，呈?，F(xiàn)兩吃條區(qū)荒帶；繭通過(guò)魂比較也兩區(qū)舟帶的閉度，步或測(cè)壤定兩嶼區(qū)帶舟的放抄射性杠強(qiáng)度假，即窗可推疏算出傾目的DN垮A的拷嚷貝數(shù)瘋。43定量PC忙R技術(shù)界：競(jìng)摟爭(zhēng)定花量PC高R實(shí)時(shí)靠熒光故定量PC旨R定量PC稈R技術(shù)蒜與逆渣轉(zhuǎn)錄戴結(jié)合言，可伐以檢測(cè)mR隆NA的絕蓄對(duì)含扔量。4445⒊多重PC孝R被檢肯基因萬(wàn)太長(zhǎng)(2縣kb以上)存在孫多個(gè)床位置恰的缺耗失和烘突變方法俱：用多對(duì)引物暢同時(shí)統(tǒng)擴(kuò)增給一份DN妄A樣品套的不禿同序逼列區(qū)志域，趁每對(duì)景引物四所擴(kuò)鐵增產(chǎn)耗物長(zhǎng)燈度不輸同，珠根據(jù)嶼電泳訂結(jié)果雨判斷但是否隔存在貢某些喬基因胸片段揚(yáng)得缺餃?zhǔn)Щ蚩蓍L(zhǎng)度進(jìn)改變?nèi)?。這勿樣一詳次反僚應(yīng)就焰可以約檢測(cè)宜多個(gè)霉變異住位點(diǎn)矩。46⒋重組PC赤R研究丈基因犯結(jié)構(gòu)賊與功乎能的深關(guān)系本，常音需要帥突變市基因臟結(jié)構(gòu)旬，如朱堿基鑒替代辦、缺桂失或攜插入奔等，勺以觀賤察基榴因功崇能的塞改變桑。通常包的方該法是纏用合杜成帶品突變鄉(xiāng)豐的引攻物，大復(fù)制續(xù)完整候的突菊變基修因。PC旺R能使廁體外慣定點(diǎn)乒突變粱簡(jiǎn)便雖快捷離，PC唯R參與蕉的體飲外基間因突注變過(guò)暗程稱金為重揉組PC成R，。47⒌不對(duì)窗稱PC陪R典型斑的PC喊R擴(kuò)增隨產(chǎn)物斤是特剝異的窯雙鏈DN為A分子碧。如呆在反艱應(yīng)體乖系中駐加入晚不同雜濃度父（兩粒條引冬物的便濃度就比一潮般為50－10稠0:私1）的政兩條窄引物忌即可盒獲得畝特定光的單霉鏈DN卷A，稱獄為不薪對(duì)稱PC游R。DN剃A測(cè)序傍及基估因診貍斷中壁常常佛需要宣大量叔單鏈DN宣A48⒍原位PC行R將組鳳織或勢(shì)細(xì)胞猜經(jīng)過(guò)危固定脾處理薯，使臟細(xì)胞拒膜具抵有一那定的德通性近，然陣后在洽細(xì)胞星內(nèi)建恢立PC沈R體系鋤，擴(kuò)腦增細(xì)車胞內(nèi)從的DN饅A或RN貓A靶序速列，濃這一糟過(guò)程恩稱為佳原位PC歇R可用跪于腫靠瘤發(fā)乏生學(xué)