第三章測序技術詳解

第三章測序技術詳解演示文稿當前第1頁\共有38頁\編于星期三\8點優(yōu)選第三章測序技術當前第2頁\共有38頁\編于星期三\8點人類基因組計劃

人類基因組計劃（Humangenomeproject）于1990年啟動，我國于1999年加入該計劃，承擔其中1%的任務，即人類3號染色體短臂上約30Mb的測序任務。美國擔了54%，其次是英國，承擔了33%，日本為7%，法國為2.8%，德國為2.2%。

當前第3頁\共有38頁\編于星期三\8點二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成當前第4頁\共有38頁\編于星期三\8點2000年6月公共領域測序計劃工作框架圖當前第5頁\共有38頁\編于星期三\8點2002.112004.12水稻和雞基因組當前第6頁\共有38頁\編于星期三\8點華大基因于2007年10月完成了第一個中國人的高質(zhì)量基因組圖譜——“炎黃一號”2008年1月12日由中國、英國和美國的科學家在深圳、倫敦和華盛頓同時宣布國際“千人基因組計劃”正式啟動。最終目標是獲得歐、亞、美、非各洲不同人群中2500人的基因數(shù)據(jù)。

人基因組當前第7頁\共有38頁\編于星期三\8點大熊貓基因組-2010.1“大熊貓基因組”項目于2008年3月啟動。研究表明，大熊貓有21對染色體，基因2萬多個。當前第8頁\共有38頁\編于星期三\8點

破解古人類基因組-2010.2

“薩卡克(Saqqaq)”的人類群體，約在4750年前至2500年前居住于格陵蘭島，其后滅絕。Saqqaq古人的遺傳信息比公認的美洲原住民(主要是印第安人和因紐特人，同屬黃種人)更加接近于現(xiàn)代東亞和西伯利亞人群。當前第9頁\共有38頁\編于星期三\8點人體腸道菌群元基因組-2010.3

收集了124個來自于歐洲人腸道菌群的樣本,這個基因集中包含了絕大部分目前已知的人體腸道微生物基因,但更多的是目前未知微生物的基因。從這個基因集中可以估計人腸道中存在約1000到1150種細菌,平均每個體內(nèi)約含有160種優(yōu)勢菌種,并且這些細菌是絕大部分個體所共有的。

當前第10頁\共有38頁\編于星期三\8點2009年4月啟動了“世界三極動物基因組計劃”2009年8月啟動了“萬種微生物基因組計劃”。2010年1月啟動了“1000種動植物基因組計劃”，計劃未來兩年內(nèi)為一千種重要動植物進行測序，并從科學界征集測序物種的提案。

當前第11頁\共有38頁\編于星期三\8點（一）化學裂解法(Maxam＆Gilbert,1977)（二）雙脫氧鏈末端終止法(Sanger,1977)（三）DNA自動化序列分析解讀生命的天書-DNA測序當前第12頁\共有38頁\編于星期三\8點

DNA測序技術基礎：

●高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技術

●

PAGE能分離長度為300-500個堿基,差別僅1個堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。

當前第13頁\共有38頁\編于星期三\8點核酸序列分析的基本原理化學降解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)當前第14頁\共有38頁\編于星期三\8點一、化學降解法測序的原理1、用放射性核素標記待測DNA一側(cè)末端2、將標記DNA分為G、A+G、C+T、C4個反應體系3、用不同的化學試劑處理不同反應體系，隨機斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物4、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列當前第15頁\共有38頁\編于星期三\8點堿基特異性修飾及裂解反應體系堿基修飾試劑堿基修飾反應主鏈斷裂試劑斷裂點G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C當前第16頁\共有38頁\編于星期三\8點

化學降解G反應模式圖硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet當前第17頁\共有38頁\編于星期三\8點化學降解法基本步驟

(1)先將DNA的末端之一進行標記(通常為放射性同位素32P；(2)在多組互相獨立的化學反應中分別進行特定堿基的化學修飾；(3)在修飾堿基位置化學法斷開DNA鏈；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列.

當前第18頁\共有38頁\編于星期三\8點當前第19頁\共有38頁\編于星期三\8點CT+CG+AATTGTCAGGAC試試看當前第20頁\共有38頁\編于星期三\8點二、雙脫氧鏈終止法（Sanger法）原理

DNA鏈中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基團，在DNA合成、鏈的延長過程中，新?lián)饺氲拿撗鹾塑账?’-p與前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯鍵相連。

當前第21頁\共有38頁\編于星期三\8點Sanger法是在反應體系中加入2’,3’-ddNTP，由于其沒有3’-OH而不能與下一個核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。當前第22頁\共有38頁\編于星期三\8點在PCR時加入標記的復制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應于4種堿基）ddX的兩個作用：可以當作正常堿基參與復制一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接電泳誰終止，堿基就是誰此方法獲1980年的Nobel獎Sanger法：當前第23頁\共有38頁\編于星期三\8點當前第24頁\共有38頁\編于星期三\8點當前第25頁\共有38頁\編于星期三\8點5’3’5’AGCTATCAGCGAAT雙脫氧鏈終止法DNA序列分析原理示意圖當前第26頁\共有38頁\編于星期三\8點序列識讀自下而上，5’3’所讀序列為模板的互補鏈當前第27頁\共有38頁\編于星期三\8點三、DNA測序自動化和大規(guī)模測序特點:原理同sanger法標記物為熒光染料（與雙脫氧核苷三磷酸共價相連)激光掃描自動測序結(jié)果清晰、準確、分辨率高測序速度快當前第28頁\共有38頁\編于星期三\8點DNA自動測序步驟：

4種帶有不同熒光染料標記的終止物ddNTPsSanger測序反應反應產(chǎn)物毛細管電泳分離激光激發(fā)、熒光信號采集、計算機分析與DNA自動排序。當前第29頁\共有38頁\編于星期三\8點第一步：加入復制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快當前第30頁\共有38頁\編于星期三\8點第二步：熒光檢測當前第31頁\共有38頁\編于星期三\8點DNA自動測序與手工測序的不同點1、標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動測序采用4種熒光染料分別標記ddNTP或標記引物2、加樣方式不同：手工測序，一個樣品的4個測序反應物分別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內(nèi)電泳3、檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從4種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出DNA序列，而自動測序則采用激光掃描器同步掃描，計算機進行閱